李清賢 孫 倩 宋喜發(fā) 唐疾飛 王堯杰 牛宇欣 包其郁 張國(guó)強(qiáng) 胡云良

原發(fā)性高血壓是一種多基因遺傳性疾病，由多對(duì)等位基因(共顯性基因)控制，并受環(huán)境因素影響，是心腦血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。鈣離子拮抗劑(CCB)作為臨床治療高血壓病的一線藥物，是一種公認(rèn)的有效抗高血壓藥和動(dòng)脈擴(kuò)張藥，它通過阻滯Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)特異性L型Ca2+通道而發(fā)揮作用［1］。但不同EH患者群體及個(gè)體對(duì)CCB呈現(xiàn)不同的降壓反應(yīng)，推測(cè)可能與遺傳素質(zhì)的不同有關(guān)［2］，本實(shí)驗(yàn)選取CACNB2的6個(gè)SNP位點(diǎn)，選擇服用單一鈣離子通道阻滯劑(CCB)的EH患者進(jìn)行臨床跟蹤隨訪觀察療效，旨在探討CACNB2基因多態(tài)性與CCB降壓療效的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

1．實(shí)驗(yàn)對(duì)象:于溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院、鹿城區(qū)人民醫(yī)院以及溫州市部分街道衛(wèi)生服務(wù)中心，隨機(jī)選取104名EH患者，按照2004年《中國(guó)高血壓防治指南》高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn):未治療前非同日3次測(cè)量，收縮壓≥140mmHg和(或)舒張壓≥90mmHg者，或者血壓＜140/90mmHg，但正在服用降壓藥者。男性60例，女性44例，平均年齡47．39±9．42歲。并排除繼發(fā)性高血壓、糖尿病、活動(dòng)性甲狀腺功能亢進(jìn)、貧血、周圍血管疾病、大動(dòng)脈炎、先天性血管畸形，排除不適合服用CCB患者。且所有研究對(duì)象簽署知情同意書入選。

2．研究方法:(1)用藥方法:對(duì)診斷發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性高血壓病例服用納欣同(浙江泰利森藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):090404)20mg，每日1次。之前正在服用其他降壓藥物治療的病例需在入選后停用原降壓藥物2周之后服用納欣同。在每一天的同一時(shí)間段服用，期間不用其他任何影響血壓的藥物。(2)觀察指標(biāo):服藥前及服藥后的第2、4、6周末各隨訪1次，按照血壓測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)方法由專人在固定時(shí)間段測(cè)量血壓值，并做以記錄。(3)療效判斷標(biāo)準(zhǔn):治療6周末，收縮壓降低值大于等于20mmHg，舒張壓降低值大于等于10mmHg，或者未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)，但是降至正常范圍，均視為治療有效。(4)標(biāo)本的采集:治療前空腹抽取靜脈血5ml，2ml入EDTA抗凝管中，－70℃低溫儲(chǔ)存，以備用于標(biāo)本統(tǒng)一提取基因組DNA，3ml用于分離血清檢測(cè)血脂、血糖、肝腎功能等生化指標(biāo)。

3．基因擴(kuò)增及分型:(1)儀器與試劑:Applied Biosystems公司的GeneAMPPCR System9700;MassARRAY Compact System;人血全基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)血AXYGEN公司，多重PCR引物及延伸引物由SEQUENOM公司Assay Design3．1程序進(jìn)行設(shè)計(jì)由北京擎科公司合成，PCR引物及延伸引物序列(表1)。(2)PCR及SNP分型:利用多重PCR技術(shù)對(duì)目的序列進(jìn)行擴(kuò)增，采用多重PCR技術(shù)對(duì)所選的6個(gè)包括SNP位點(diǎn)在內(nèi)的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。(按800個(gè)標(biāo)本配制PCR反應(yīng)Mix，加入6對(duì)引物，每一個(gè)標(biāo)本對(duì)應(yīng)的孔反應(yīng)體系:總體系5μl中含:10ng/μl的 DNA 2μl;Buffer 0．5μl;25mmol/L MgCl20．4μl;25mmol/L dNTPMix 0．1μl;0．5μmol/L Primer Mix 1μl，5U/μl PCR Enzyme 0．2μl，剩余加去離子水 0．8μl至 5μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，45個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min)在上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入ddNTP，通過單堿基延伸只能延伸一個(gè)堿基(約20bp)對(duì)目的SNP位點(diǎn)進(jìn)行延伸(反應(yīng)體系:iPLEX GOLDBuffer 0.2μl;iPLEX Termination mix 0.2μl;iPLEX Enzyme 0.041μl;iPLEX Extend Primer Mix 0.94μl;iPLEX GOLD Buffer 0.2μl;Nanopure water 0．619μl;共 2μl加入至上一步的體系中共9μl，反應(yīng)條件:①94℃預(yù)變性 30s;②94℃變性5s;③52℃退火5s;④80℃延伸5s;③④循環(huán)5次;然后②③④循環(huán)40次;⑤94℃ 延伸5s。)產(chǎn)物通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI－TOF MS)基因分型技術(shù)，進(jìn)行SNP分型。

表1 CACNB2基因6個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR延物及單堿基延伸產(chǎn)物設(shè)計(jì)

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)分析軟件，群體代表性檢驗(yàn)采用Hardy－Weinberg平衡法;概率用P表示，p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．質(zhì)譜分析結(jié)果:根據(jù)單堿基延伸產(chǎn)物分子質(zhì)量不同確定其基因型，經(jīng)MALD1－TOF檢測(cè)分析，在6個(gè)位點(diǎn)中，除rs7069292在人群中只發(fā)現(xiàn)兩種基因型TT和CT，其余5個(gè)位點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)3種基因型均可得到3種質(zhì)譜圖形(兩種純合型和一種雜合型)單峰為純合型，雙峰為雜合型。以rs10764319 C/T多態(tài)性的質(zhì)譜圖為例作說(shuō)明(圖1)。

圖1 rs10764319 C/T多態(tài)性的質(zhì)譜圖

2．群體代表性檢驗(yàn):高血壓患者和血壓正常者CACNB2基因的6個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＞0．05，符合 Hardy－Weinberg平衡，表明研究對(duì)象來(lái)自同一群體具有群體代表性。

3．服用鈣拮抗劑者各個(gè)位點(diǎn)不同基因型療效的差異(104例):對(duì)服用單一鈣拮抗劑隨訪6周到底的104例EH病例進(jìn)行病例自身對(duì)照研究，經(jīng)R×C表卡方檢驗(yàn)和四格表卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，rs11014166 SNP攜帶AA基因型的病例對(duì)鈣拮抗劑有效率顯著高于AT+TT基因型攜帶者的有效率，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異顯著(p＜0．05)，其余5個(gè)位點(diǎn)各基因型之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0．05)(表2)。

討 論

鈣離子通道分為三型:L型、N型、T型，其中L型最重要，主要分布在血管平滑肌和心肌，L型電壓依賴性鈣離子通道(L－VDDC)包括α1、α2δ和β亞單位。其中α1亞基最重要，由它組成親水孔道調(diào)控Ca2+內(nèi)流。Ca通道藥理學(xué)、電生理學(xué)的差異主要取決于α1亞基的種類［3］。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，人為地使機(jī)體動(dòng)脈血壓升高，可使α1C亞基上調(diào)，鈣離子通道數(shù)目增多，提示血壓與鈣離子通道數(shù)目也呈正相關(guān)［4］。輔助亞基β2(CACNB2)編碼電壓門控離子通道β2亞基，定位于染色體10p12［5］。主要通過與α 亞基結(jié)合調(diào)節(jié) L－VDDC 活性［6～10］。改變 Ca2+內(nèi)流的數(shù)量，影響α1亞基的功能。α1亞基在高血壓時(shí)表達(dá)增加，使鈣通道數(shù)量增多，從而加速高血壓的發(fā)展，故能使α1C亞基數(shù)目恢復(fù)正常的藥物，有望用于臨床治療高血壓。鈣離子拮抗劑通過與鈣離子通道靶位點(diǎn)結(jié)合，抑制鈣離子通道活性，從而抑制鈣離子從膜外向膜內(nèi)內(nèi)流，降低細(xì)胞收縮，導(dǎo)致血管擴(kuò)張，從而達(dá)到降低血壓的目的。

表2 服用鈣拮抗劑者各位點(diǎn)不同基因型療效的差異(n=104)

我們的研究通過對(duì)104例隨訪6周觀測(cè)血壓變化的EH病例進(jìn)行CACNB2基因型高血壓關(guān)系分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs11014166攜帶AA基因型鈣拮抗劑有效率顯著高于AT+TT基因型攜帶者，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(p＜0．05)，rs11014166的基因AA基因型對(duì)鈣拮抗劑比較敏感，降壓效果較其他兩種基因型明顯，推測(cè)rs11014166位點(diǎn)多態(tài)性可能影響鈣拮抗劑對(duì)EH療效，該位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域，推測(cè)可能通過影響轉(zhuǎn)錄過程，影響到基因的表達(dá)改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能，導(dǎo)致β2與α1亞基結(jié)合改變，致使L－VDCC活性改變，從而導(dǎo)致血壓的變化。我們可以推測(cè)，CACNB2多態(tài)性位點(diǎn)的突變，可能會(huì)通過影響CACNA1C的功能調(diào)節(jié)，或直接影響L－VDCC的功能，進(jìn)而影響到其與靶位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致鈣拮抗劑藥物療效出現(xiàn)差異。另外近來(lái)藥物學(xué)方面的研究，設(shè)計(jì)出的一種變異的β亞基，通過它影響α1C亞基，進(jìn)而影響鈣離子通道數(shù)目減少鈣離子的內(nèi)流，影響興奮收縮偶聯(lián)。其利用Ca2+v1．2的變異，或利用變異的β或α2δ亞基，后兩亞基自身結(jié)構(gòu)改變或者與α1亞基結(jié)合改變影響其對(duì)血管上的α1C亞基的調(diào)節(jié)，間接的特異的減少血管上L型鈣通道的數(shù)量，設(shè)計(jì)出新型的降壓藥物［11］。其余5個(gè)SNP位點(diǎn)治療療效在每個(gè)位點(diǎn)的不同基因型間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是因?yàn)闃颖玖可伲闃诱`差造成，同時(shí)部分位點(diǎn)的部分基因樣本含量太少，或許并不能真實(shí)反應(yīng)相應(yīng)攜帶者的實(shí)際藥物反應(yīng)水平，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，做進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證。

本研究首次在國(guó)內(nèi)探討了鈣離子通道輔助亞基CACNB2多態(tài)性對(duì)鈣拮抗劑治療EH患者療效差異，為EH臨床個(gè)體化有效用藥提供藥物遺傳學(xué)依據(jù)。

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