李春艷 陳永平 申春燕

肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，在肝損傷過程中，肝星狀細(xì)胞增殖并向肌成纖維樣細(xì)胞分化，這一過程是可以逆轉(zhuǎn)的。肝纖維化的發(fā)病機(jī)制主要是肝星狀細(xì)胞的增殖和凋亡是否能達(dá)到平衡，若HSC的活化增加或其凋亡減少，都會(huì)導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。因此抑制肝星狀細(xì)胞的活化與增殖、誘導(dǎo)其凋亡都會(huì)對(duì)肝纖維化過程起到預(yù)防和治療作用［1，2］。盡管近年來對(duì)這方面的研究很多，但具體的分子機(jī)制和調(diào)控過程還待進(jìn)一步研究。

組織蛋白酶B(cathepsin B)是溶酶體內(nèi)最重要的組織蛋白酶，屬于木瓜蛋白家族，廣泛分布于各種組織細(xì)胞的溶酶體中，主要降解各種組織蛋白。近年發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B除參與重要的生理功能外還與人類多種疾病如腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、多發(fā)性硬化癥、動(dòng)脈粥樣硬化、腎纖維化、肺纖維化、肝纖維化、皮膚光老化等慢性疾病有關(guān)，因此備受關(guān)注［3～11］。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)材料及試劑:大鼠肝星狀細(xì)胞T6系，購自湖南湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibico公司;α－SMA鼠多克隆一抗購自美國Sigma公司;組織蛋白酶B兔多克隆一抗購自美國Santa cruz公司;組織蛋白酶B抑制劑(Z－FA－FMK)購自美國Santa cruz公司;磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)小鼠單克隆一抗、辣根過氧化物酶(HRP)二抗購自北京中衫公司;組織/細(xì)胞強(qiáng)效裂解液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(購自上海碧云天生物技術(shù)研究所);RNA Iso試劑盒(購自大連寶生物公司)。

2．實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng):分對(duì)照組和抑制劑組，細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時(shí)，以2×105接種到六孔板中，待細(xì)胞完全貼壁，對(duì)照組12、24、36、48h 的細(xì)胞只換培養(yǎng)液;抑制劑組 12、24、36、48h的細(xì)胞換培養(yǎng)液后分別加入26nmol/L的Z－FA－FMK。將凍存的HSC－T6細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長鋪滿培養(yǎng)板的85%左右時(shí)，用0．25%胰酶消化后傳代，24h換液，72h再次傳代，每次試驗(yàn)均在呈指數(shù)生長的細(xì)胞中進(jìn)行。

3．Western blotting法檢測(cè) cathepsin B、α －SMA:采用放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)組織/細(xì)胞強(qiáng)效裂解液抽提對(duì)照組和抑制劑組12、24、36、48h的 HSC－T6細(xì)胞總蛋白，用 BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，濃度測(cè)定后用裂解液進(jìn)行配平，使得各時(shí)間點(diǎn)總的蛋白濃度相同。所有操作參照Western blotting實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。cathepsin B和α－SMA一抗1∶800稀釋，內(nèi)參GAPDH一抗1∶1000稀釋，小鼠抗大鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗1∶5000稀釋，羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗1∶3000稀釋。底物增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色，洗片顯帶，膠片掃描，用Gel－pro3．1軟件測(cè)量 cathepsin B、α －SMA 和 GAPDH的平均光密度，用cathepsin B、α－SMA與GAPDH的比值表示各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

4．RNA提取:采用RNA Iso試劑盒，按說明書提取HSCT6細(xì)胞總RNA。采用分光光度法測(cè)定提取的總RNA含量和純度，A260nm/A280nm比值在1．8～2．0范圍。

5．RT－PCR檢測(cè)cathepsin B mRNA、TGF－βmRNA和α－SMA mRNA:RT－PCR按鳥類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)試劑盒按說明書操作。采用Premer5軟件設(shè)計(jì)引物序列，由上海捷瑞公司合成。TGF－β、α－SMA、cathepsin B與actin－β的PCR引物序列及反應(yīng)條件見表1。PCR產(chǎn)物在1．5%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描，用Gel－pro3．1分別測(cè)量TGF－β、α－SMA、cathepsin B、actin－β的平均積分吸光度。用TGF－β、α－SMA、cathepsin B與actin－β的比值來表示各自mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s)表示。樣本均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。雙變量均服從正態(tài)分布的相關(guān)性討論采用Pearson直線相關(guān)分析，否則采用Spearman秩相關(guān)，p＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列及反應(yīng)條件

結(jié) 果

1．倒置顯微鏡觀察結(jié)果:抑制劑組細(xì)胞12h后有細(xì)胞脫落，懸浮于上清中，隨時(shí)間的增加，上述情況有所改善。較對(duì)照組細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞間隙較寬，細(xì)胞皺縮，核染色質(zhì)濃集呈球形，見圖1A。對(duì)照組HSC－T6細(xì)胞隨著時(shí)間的延長，形態(tài)和數(shù)量都有明顯的變化，12h時(shí)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈圓形、梭形、三角形等，細(xì)胞數(shù)量較少;24h時(shí)細(xì)胞呈星形，星芒狀突起豐富，高倍鏡下細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則形，核仁圓形，清晰可見，細(xì)胞數(shù)量較多。對(duì)照組24h細(xì)胞呈肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(myofibroblast－ like cell，MFB)外形，未見到核染色質(zhì)濃集，見圖1B。

圖1 對(duì)照組和抑制劑組各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長狀態(tài)

2．Western blotting印跡法檢測(cè) cathepsin B、α －SMA結(jié)果:HSC隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，向成纖維肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在培養(yǎng)過程中不同時(shí)間點(diǎn)cathepsin B的表達(dá)也不同，結(jié)果顯示，對(duì)照組隨著時(shí)間的延長cathepsin B的表達(dá)增加，進(jìn)一步說明cathepsin B參與了HSC的增殖和分化;抑制劑組在加入組織蛋白酶B抑制劑 Z－FA－FMK后由 cathepsin B表達(dá)量(0.49±0．04)較對(duì)照組(0．68 ±0．09)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= －6．31，P ＜0．05)，說明 Z －FA－FMK能有效抑制cathepsin B蛋白的表達(dá)，見圖2、圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)α－SMA的變化趨勢(shì)與cathepsin B的變化趨勢(shì)相平行。α－SMA作為HSC向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，對(duì)照組隨時(shí)間的延長α－SMA的表達(dá)量增加;抑制劑組在加入Z－FA－FMK 12、24、36、48h 后，α － SMA 的表達(dá)量(0．64 ±0．03)較對(duì)照組(0．79±0．01)有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= －6．18，P ＜0．05)(圖 2、圖3)。

3．RT－PCR 檢測(cè) cathepsin B mRNA、TGF－β mRNA和α－SMA mRNA結(jié)果:對(duì)照組cathepsin B mRNA的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長而增加，抑制劑組cathepsin B mRNA 的表達(dá)量(2．00±0．11較對(duì)照組(2．24±0．47)有所下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－3．41，P ＜0．05)。對(duì)照組 TGF－β mRNA 隨著時(shí)間的延長表達(dá)量增加，抑制劑組TGF－βmRNA的表達(dá)量(1.43 ±0．16)較對(duì)照組(1．81 ±0．21)有所減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6．44，p＜0．05)。對(duì)照組α－SMA mRNA隨著時(shí)間的延長表達(dá)量增加，抑制劑組α－SMA mRNA的表達(dá)量(0．40±0．06)較對(duì)照組(0．81±0．08)有所減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－4．28，P ＜0．05)(圖 4、圖 5)。

4．相關(guān)性分析:cathepsin B與α－SMA的表達(dá)量呈正相關(guān)(蛋白水平:r=0．97，P ＜0．05;mRNA 水平:r=0．84，P ＜0．05)，說明 α －SMA 的表達(dá)量的變化與cathepsin B表達(dá)量的變化平行。

討 論

肝纖維化是肝臟對(duì)各種病因所致的慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是以膠原分泌為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積，HSC在肝纖維化進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，是肝纖維化時(shí)ECM合成的主要來細(xì)胞。TGF－β是調(diào)控肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心因子，以表達(dá)α－SMA為標(biāo)志的活化的肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝內(nèi)ECM的主要來源

組織蛋白酶B是主要的溶酶體蛋白酶，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移歸因于廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)重塑和細(xì)胞死亡途徑的調(diào)控［4］。盡管已有研究證明組織蛋白酶參與肝纖維化形成，但它們?cè)贖SC生物性調(diào)控和纖維形成中的作用還不清楚［8，10］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，組織蛋白酶B參與了HSC的增殖和分化;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)α－SMA的變化趨勢(shì)與組織蛋白酶B的變化趨勢(shì)相平行。證明了HSC隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長會(huì)向成纖維肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制cathepsin B的活性能夠減緩或抑制HSC的增殖以及向成纖維肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，為組織蛋白酶B在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用提供了依據(jù)。

Okuyama的研究顯示分泌的CTB可下調(diào)PDGFβR，使 PDGF不能誘導(dǎo)靜止期 HSC 的增殖［12］。Anna Moles所做的研究顯示組織蛋白酶B通過異常的機(jī)制能直接調(diào)控HSC增殖［10］。組織蛋白B的遺傳和藥理性拮抗作用都能抑制活化的鼠HSC或永生的人Lx2細(xì)胞。而不是通過調(diào)節(jié)降低PDGFβR對(duì)與其配對(duì)的PDGF，組織蛋白酶的抑制通過PDGF影響AKT的磷酸化。這些研究結(jié)果顯示組織蛋白酶B確實(shí)通過PDGF調(diào)控PI3K/AKT途徑。PDGF在體外激發(fā)后cathepsin B活性的缺失后AKT的活化減低的確切機(jī)制和參與這一過程的主要蛋白是今后最重要也是最有價(jià)值的研究。

組織蛋白酶和內(nèi)涵體早晚期的標(biāo)記共區(qū)域化顯示溶酶體組織蛋白的釋放是隨著分泌途徑來調(diào)節(jié)ECM成分和質(zhì)膜HSC受體的［10］。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，在HSC－T6細(xì)胞培養(yǎng)過程中，cathepsin B的表達(dá)量隨時(shí)間的延長而增加，Z－FA－FMK作用后cathepsin B的表達(dá)量較對(duì)照組有所減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，cathepsin B防止HSC增殖，下調(diào)負(fù)性調(diào)控HSC活化的表型標(biāo)志物的表達(dá)，如A－SMA，TGF－β。本實(shí)驗(yàn)研究還表明cathepsin B的變化趨勢(shì)與肝纖維化常用指標(biāo)TGF－β和α－SMA表達(dá)量的變化趨勢(shì)一致，且較對(duì)照組明顯減少。這些結(jié)果都顯示半胱氨酸組織蛋白酶直接調(diào)控HSC活化后早期轉(zhuǎn)分化和永生化，是調(diào)控他們潛在纖維化和最終肝纖維化的關(guān)鍵。然而，Anna Moles等發(fā)現(xiàn)在原始小鼠HSC中TGF－β的表達(dá)減少，TGF－βmRNA的表達(dá)的水平在LX2細(xì)胞中沒有變化，表明這些細(xì)胞比5天的小鼠HSC更加分化，并且在這一分化階段TGF－β的調(diào)控可能不同［13，14］。本實(shí)驗(yàn)研究顯示HSC－T6細(xì)胞TGF－β的表達(dá)量隨時(shí)間的延長而增加，但抑制劑作用后TGF－β與TGF－βmRNA的表達(dá)量都較對(duì)照組有所降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

許多文獻(xiàn)顯示在炎癥過程中組織的局部會(huì)出現(xiàn)PH的降低，有利于分泌的組織蛋白酶的活化。事實(shí)上，組織蛋白酶的分泌和許多腫瘤實(shí)質(zhì)的侵襲和轉(zhuǎn)移都有關(guān)，說明組織蛋白酶B通過降解ECM成分或激活其他基質(zhì)降解蛋白如尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑來促進(jìn)侵入［3，15］。假如組織蛋白酶 B對(duì)活化的HSC的增殖和纖維形成有作用，我們將進(jìn)一步研究他們對(duì)體內(nèi)肝纖維化的影響。之前Canbay在膽道結(jié)扎的肝纖維化模型中的研究認(rèn)為組織蛋白酶B參與了肝臟的膽汁淤積引起的炎癥、細(xì)胞凋亡、最終導(dǎo)致肝纖維化形成，敲除CTB基因或用CTB藥物抑制劑后大鼠肝臟炎性損傷及纖維化形成減輕［9］。

Anna Moles分析了cathepsin B在CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中的作用［10］。Anna Moles所做的研究顯示對(duì)cathepsin B進(jìn)行藥理學(xué)抑制能防止α－SMA的增加、膠原合成和CCl4誘導(dǎo)引起的中性粒細(xì)胞的侵潤。組織蛋白酶抑制劑不能改善由CCl4導(dǎo)致的肝損傷，反映了組織蛋白酶B與肝細(xì)胞損害有刺激依賴性［7，16］。此外，CCl4作用在 HSC 后 cathepsin B 的表達(dá)量增加，在肝細(xì)胞中未被檢出，由組織蛋白酶活性的生化檢查和GFAP染色法，我們不能排除cathepsin B參與肝臟其他成肌纖維細(xì)胞樣細(xì)胞群。

cathepsin B參與了人類多種重要的生理功能及病理進(jìn)程，本實(shí)驗(yàn)研究證明cathepsin B調(diào)控HSC的增殖和分化，它的抑制劑可以下調(diào)纖維化指標(biāo)α－SMA、TGF－β的表達(dá)，進(jìn)而參與了肝纖維化形成過程，這一研究為進(jìn)一步探索肝纖維化形成的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，cathepsin B可作為今后治療肝纖維化治療的靶點(diǎn)。

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