楊文君 黃宏杰 劉 娟 吳翔燕 胡向榮

成釉細胞瘤(ameloblastoma，AM)是頜骨最常見的牙源性上皮性腫瘤，生物學(xué)行為具有局部侵襲性。從組織學(xué)上看，AM的主要亞型在某些方面與成釉器非常相似。以往的研究顯示Notch1信號途徑在成牙中起重要作用［1］。Notch1在牙發(fā)育早期階段的表達與成釉細胞命運決定有關(guān)，但Notch1在AM中的作用仍不清楚。鑒于一些研究報道Notch1信號途徑與其他信號途徑如EGFR/Ras/MAPK在許多情況下存在直接或間接的交互作用，且EGFR在牙源性上皮和AM中廣泛表達，因此本實驗同時檢測Notch1和EGFR在頜骨AM中的表達，旨在探討Notch1和EGFR在 AM 中的作用［2，3］。

材料與方法

1．一般資料:本組69例AM標(biāo)本，均選自浙江大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院病理科1994～2005年間手術(shù)存檔標(biāo)本。其中男性41名，女性28名，年齡11～70歲(中位年齡33．7歲)。發(fā)生在下頜骨的62例，上頜骨的7例。實性/多囊型56例(其中濾泡型22例，叢狀型27例，棘皮瘤型7例)，單房型13例。所有標(biāo)本均用10%中性甲醛溶液固定并石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，由2名病理專家確診，組織學(xué)分類根據(jù)2005年WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)確定［4］。5例牙胚組織做對照。

2．方法:一抗羊抗人Notch1多克隆抗體(sc－6014)和兔抗人EGFR單克隆抗體(sc－03)均購自美國的Santa Cruz公司，實驗中稀釋濃度分別為1∶75和1∶100，二抗試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，所有操作步驟按試劑盒說明進行。用PBS代替一抗的切片作為陰性對照。已知Notch1陽性表達的正?？谇火つず虴GFR陽性表達的舌鱗癌切片分別作為陽性對照。

3．結(jié)果判斷:Notch1和EGFR蛋白陽性染色主要位于腫瘤細胞的胞膜，或胞膜及胞質(zhì)均有陽性染色。陽性強度:無陽性染色為0分，弱陽性為1分，中等強度為2分，強陽性為3分。陽性細胞率為:0%為0，1% ～25% 為1，26% ～50% 為2，51% ～75% 為3，大于75%為4。每一切片總記分為陽性強度和陽性率的乘積。相應(yīng)的評分有9個等級，即0、1、2、3、4、6、8、9、12。而且對實性/多囊型 AM 的每一例標(biāo)本，分別對外周細胞和中央?yún)^(qū)細胞的染色情況進行記分評價。Notch1和EGFR的表達結(jié)果判定如下:評分0～1分為－，2～7分為+，≥8分為++。最后的記分為兩名專家的平均分。

4．統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS13．0統(tǒng)計學(xué)軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，p＜0．05認為有顯著性差異。

結(jié) 果

所有標(biāo)本均有Notch1和EGFR陽性染色。陽性染色主要位于腫瘤細胞的胞膜，或胞膜及胞質(zhì)均有陽性染色，但陽性表達的強弱分布不同。5例牙胚組織中，Notch1和EGFR主要表達于內(nèi)釉上皮，星網(wǎng)層細胞低表達(圖1、圖2)。對于AM，尤其實性/多囊型這一主要類型而言，高表達的Notch1和EGFR主要分布于腫瘤島外周柱狀或立方狀細胞，而低水平的Notch1和EGFR表達主要位于中央星網(wǎng)狀細胞(表1、圖3～圖8)。Notch1和EGFR在牙胚和AM中的表達比較，組間均無顯著性差異(P＞0．05)(表2、表3)。在AM中，Notch1和 EGFR的表達非常相似，Notch1和EGFR的表達存在相關(guān)性(p＜0．05)(表4)。

討 論

在牙胚和牙齒發(fā)育形成過程中，部分牙源性上皮細胞的分裂、分化和凋亡失去控制，細胞不能正常退化而保持分裂增殖的能力，在一系列基因及產(chǎn)物的調(diào)解下，殘余的牙源性上皮細胞可以發(fā)展為成釉細胞瘤［5］。

Notch和EGFR信號途徑是兩條廣泛存在且高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它們以不同的機制調(diào)控諸多的生命過程，在維持細胞增殖、分化和凋亡中起重要作用。Notch受體屬于進化保守的I型跨膜糖蛋白受體家族。在哺乳動物細胞中，有4種 Notch受體(稱Notch1，2，3，4)和5種配體［稱 Jagged1，2和 Deltalike(Dll)1，3，4］［6］。這一信號途徑通過鄰近細胞受體－配體間直接相互作用而被激活。一旦激活，Notch通過連續(xù)的蛋白水解反應(yīng)被截斷，釋放出胞內(nèi)段(ICN，Notch的功能性激活形式)。ICN轉(zhuǎn)位于細胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄抑制子CBF－1相互作用，使CBF－1轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活子，從而調(diào)控多種靶基因的表達。研究表明，Notch信號通路對細胞的增殖、分化、凋亡、黏附、干細胞的維持和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化均有十分重要的作用，是許多重要信號通路的交點［6］。許多腫瘤的發(fā)生均與Notch信號通路的異常有關(guān)。我們現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)Notch1在AM中廣泛表達，這可能意味著Notch1與AM的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

表1 Notch1和EGFR在AM中的表達

表2 Notch1在牙胚和AM中的表達比較

表3 EGFR在牙胚和AM中的表達比較

表4 AM中Notch1和EGFR的表達間的關(guān)系

EGFR作為受體酪氨酸激酶的ebB家族的成員之一已被廣泛研究。EGFR在許多腫瘤如肺癌、腸癌、乳癌、前列腺癌等中的過表達往往與原始細胞的轉(zhuǎn)化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后不良及生存率低有關(guān)［7］。文獻報道，EGFR在一些正常組織如口腔黏膜及發(fā)育中的牙組織中表達，可能與細胞增殖、分化和凋亡有關(guān)［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，所有的AM標(biāo)本均有EGFR的表達，這一結(jié)果與文獻報道的一致，提示AM可能起源于EGFR陽性表達的牙源性上皮。

Notch1與許多信號途徑如EGFR存在交互作用，兩者之間的相互作用取決于不同的組織背景，既可以表現(xiàn)為相互協(xié)同，也可表現(xiàn)為相互拮抗。已有研究表明，Notch1與EGFR信號通路之間存在著“串話”。例如:Notch1通過P53上調(diào)EGFR的表達［9］;在乳腺癌細胞中，Notch和EGFR之間存在“串話”，Notch1和EGFR在乳腺癌中的表達水平呈正相關(guān)，并發(fā)生相互協(xié)同、相互促進的作用［10，11］。本研究中，我們用免疫組化方法檢測了Notch1受體和EGFR在AM中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有標(biāo)本Notch1受體和EGFR均陽性染色，且高水平的Notch1受體表達主要位于AM的外周柱狀或立方狀細胞中，而低水平的Notch1受體表達位于中央星網(wǎng)狀樣細胞。EGFR的表達與Notch1表達非常類似，Notch1和EGFR的表達存在相關(guān)性(p＜0．05)。因此，我們推測，在AM的發(fā)生過程中，Notch1和EGFR信號之間有協(xié)同作用，兩條通路間可能存在著“串話”。

從組織學(xué)上看，AM腫瘤性上皮的分化水平似乎維持在牙發(fā)育的帽狀期及鐘狀期階段。在鐘狀期，Notch1和EGFR表達在內(nèi)釉上皮，一旦其分化為成釉細胞，則 Notch1 和 EGFR 的表達為陰性［8，12］。亦有研究表明，AM細胞巢周邊區(qū)PCNA的表達顯著高于中心區(qū)，說明細胞巢周邊區(qū)為細胞增殖區(qū)［13］。這意味著外周細胞而非中央細胞代表著AM細胞增生的活躍部分。有趣的是，我們現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，Notch1和EGFR的強陽性染色均主要位于AM外周柱狀或立方狀細胞，此結(jié)果提示，Notch1和EGFR在AM中的作用可能是促進細胞增殖和抑制細胞分化。

綜上所述，本研究顯示，Notch1和EGFR蛋白明確地表達在AM中，其表達特征提示Notch1和EGFR在AM的發(fā)生中起潛在作用，并與腫瘤細胞的增殖有關(guān)。Notch1與EGFR的表達非常相似，因此我們推測，在AM的發(fā)生過程中，Notch1和EGFR信號之間有協(xié)同作用，兩條通路可能存在著“串話”。

1 馬亮，王勝朝，張亞慶．Notch信號與牙胚發(fā)育與牙齒損傷修復(fù)［J］．國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，36(1):64 －68

2 Vered M，Shohat I，Buchner A．Epidermal growth factor receptor expression in ameloblastoma［J］．Oral Oncology，2003，39(2):138 －143

3 Payeras MR，Sant'Ana Filho M，Lauxen IS，et al．Quantitative analysis of argyrophilic nucleolar organizer regions and epidermal growth factor receptor in ameloblastomas［J］．J Oral Pathol Med，2007，36(2):99 －104

4 Philipsen HP，Reichart PA，Slootweg PJ，et al．Pathology and genetics．Head and neck tumours［M］．Lyon:IARCPress，2005:283 －327

5 Takata T，Zhao M，Uchida T，et al．Immunohistochemical demonstration of an enamel sheath protein，sheathlin，in odontogenic tumors［J］．Virchows Arch，2000，436(4):324 －329

6 李林，羅進勇．Notch信號通路及其與腫瘤的關(guān)系［J］．臨床與實驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，9(19):1509 －1511

7 Normanno N，De Luca A，Bianco C，et al．Epidermal growth factor receptor(EGFR)signaling in cancer［J］．Gene，2006，366(1):2 － 16

8 Davideau JL，Sahlberg C，Blin A，et al．Differential expression of the full－length and secreted truncated forms of EGF receptor during formation of dental tissues［J］．International Journal of Developmental Biology，1995，39(4):605 －615

9 Purow BW，Sundaresan TK，Burdick MJ，et al．Notch － 1 regulates transcription of the epidermal growth factor through P53［J］．Carciongenesis，2008，27(5):918 －925

10 Dai J，Ma D，Zang S，et al．Cross－ talk between Notch and EGFR signaling in human breast cancer cells［J］．Cancer Invest，2009，27(5):533－540

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13 劉進忠，汪說之，陳新明，等．成釉細胞瘤腫瘤細胞巢周邊及中心區(qū)細胞增殖和分化的研究［J］．中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2002，37(1):62－64