解秋菊，許靜，王秀娟

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，山東 威海 264209）

水產(chǎn)品中氯霉素的殘留狀況

解秋菊，許靜，王秀娟

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，山東 威海 264209）

用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素的殘留，試驗(yàn)結(jié)果表明，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)半對(duì)數(shù)曲線為Y=-30.05X+37.35，R2=0.995，加樣回收率≥70.09%，所檢測(cè)的113份水產(chǎn)品中，除少數(shù)樣品外，絕大多數(shù)樣品在飼喂過(guò)程中未添加氯霉素。

酶聯(lián)免疫；水產(chǎn)品；氯霉素

氯霉素（Chloramphenieol，CAP）是一種廣譜抗生素，由于抗菌效果好，價(jià)格低廉，曾在一段時(shí)間內(nèi)廣泛用于預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也有較廣的使用范圍，在海水養(yǎng)殖中被認(rèn)為是抑制對(duì)蝦病原弧菌作用最強(qiáng)的藥物[1-2]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)氯霉素存在著嚴(yán)重的毒副作用，可引起再生障礙性貧血，粒狀白細(xì)胞缺乏癥，新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等疾病[3]。氯霉素可在動(dòng)物性食品中殘留，并通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)富集，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，而且低濃度藥物殘留會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性，對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成潛在威脅。因此動(dòng)物源性食品中氯霉素的殘留受到世界各國(guó)和地區(qū)的高度重視，近年來(lái)歐盟、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已相繼禁止氯霉素用于動(dòng)物源性食品，并明確規(guī)定氯霉素殘留限量為不得檢出[4-5]。

氯霉素殘留的檢測(cè)方法很多，Hao-Yu Shen[6]對(duì)所有氯霉素前處理方法、檢測(cè)方法作了對(duì)比，根據(jù)檢測(cè)目的不同選用的檢測(cè)方法也有差異,總結(jié)出常用的篩選和確證方法主要是ELISA和HPLC-MS-MS。酶聯(lián)免疫法（ELISA）具有簡(jiǎn)單、快速、處理樣品大、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，本文以水產(chǎn)品為檢測(cè)樣品，用大連普瑞康生物技術(shù)有限公司的氯霉素檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)樣品的氯霉素殘留。

1 材料與方法

1.1 氯霉素試劑盒

氯霉素試劑盒（靈敏度為0.05μg/kg）：大連普瑞康生物技術(shù)有限公司，包括：96孔酶標(biāo)板、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液（0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL）、10倍濃縮萃取稀釋液、10倍濃縮洗滌液、氯霉素酶標(biāo)記物、底物溶液、反應(yīng)終止液。

1.2 主要儀器

MK3型酶標(biāo)儀:Thermo公司；Scientz-10型均質(zhì)機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；ALC.210.4電子天平:ACCULAB；DRP-9082型恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；4K-15型高速冷凍離心機(jī)：Sigma公司；MS1 Minishaker：IKA；1000 μL、200 μL、20 μL微量移液器：GILSON。

1.3 樣品

石鰈、牙鲆、蝦、螃蟹、河豚、泥鰍、鮐魚(yú)、加吉魚(yú)：均來(lái)自威海各養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

魚(yú)去皮，取背部肌肉，均質(zhì)機(jī)制成均質(zhì)物；蝦、蟹去皮開(kāi)殼，取可食用部分，制成均質(zhì)物。

1.4.2 樣品制備

將3 g樣品剪碎后放入50 mL離心管中，再加入6 mL乙酸乙酯，并用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)約1min，振蕩30s。3000r/min，離心10 min，取2 mL上清液至玻璃管中，于50℃下氮?dú)獯蹈?。于玻璃管中加入正己? mL，先將殘余物完全溶解后，再加入1 mL萃取稀釋液，振蕩約30 s。3000 r/min，離心10 min，用吸管吸去上層液及中間乳化層部分，棄掉，取下層液備用。

1.4.3 樣品測(cè)定

于適當(dāng)微孔中分別加入100 μL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和100 μL已制備好的樣品溶液，每一微孔中再加入50 μL酶標(biāo)記物，每個(gè)溶液做3個(gè)平行，充分混合，室溫（25℃）下避光溫育1 h。將微孔中的反應(yīng)液甩掉，于每一微孔中加滿洗液后甩掉，重復(fù)洗3次，在吸水紙上拍干。于每一微孔中加入100 μL底物溶液，充分混合，室溫（25℃）下避光溫育20 min。向每一微孔中加入100 μL反應(yīng)終止液。用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下讀取數(shù)據(jù)。用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值（B）除以0標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值（B0），得到（B/B0）。以100×（B/B0）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對(duì)數(shù)曲線，根據(jù)每個(gè)樣品的（B/B0）值從曲線上讀出相對(duì)應(yīng)的樣品濃度。1.4.4 準(zhǔn)確度測(cè)定

向1 g北極鱈魚(yú)陰性樣品中分別加入0.45、0.90、1.80 ng的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品,每個(gè)濃度做3個(gè)平行。

2 結(jié)果

2.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果Table 1 The result of the standard CAP

根據(jù)表1檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)半對(duì)數(shù)曲線，見(jiàn)圖1。

從圖1可知，曲線方程為Y=-30.05X+37.35，R2=0.995，式中：Y為（B/B0）×100；X為標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值。

2.2 樣品測(cè)定結(jié)果

共檢測(cè)了113份待出口水產(chǎn)，各樣品的陽(yáng)性份數(shù)、陽(yáng)性率見(jiàn)表2。

從表2的結(jié)果中可以看出，石鰈、牙鲆、泥鰍3樣品都出現(xiàn)了陽(yáng)性，測(cè)定結(jié)果分別為0.515、0.117、0.383μg/kg，其他樣品的陽(yáng)性率都為0。

2.3 準(zhǔn)確度測(cè)定

準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表 2 各樣品氯霉素檢測(cè)結(jié)果Table 2 The result of samples

表 3 回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 The result of the recovery

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出：最低回收率為70.09%，最高為83.85%，試劑盒的回收率較高。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)了威海各養(yǎng)殖場(chǎng)水產(chǎn)品中氯霉素的殘留狀況，結(jié)果表明除極少數(shù)水產(chǎn)品外，絕大多數(shù)的水產(chǎn)品在飼養(yǎng)過(guò)程中未被飼喂氯霉素。

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素的殘留已得到廣泛的應(yīng)用，毛麗莎等[7]用荷蘭生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)了市售的豬、牛、羊肉和豬肝中氯霉素的殘留，然后用高效液相色譜和質(zhì)譜連用對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證，結(jié)果與試劑盒方法一致。高茂根等[8]用3種酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)了龍蝦仁、鮰魚(yú)片、腸衣中氯霉素的殘留，并對(duì)3種試劑盒的性能進(jìn)行了比較。

采用ELISA方法進(jìn)行水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測(cè)，操作步驟雖然簡(jiǎn)便，但可能影響檢測(cè)結(jié)果的因素也較多，分布在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)[9]，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

1）樣品制備最為重要。在這一過(guò)程中要盡可能多地把樣品中的氯霉素提取出來(lái)，這是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提，尤其是在最后取下層液時(shí)，一定要把乳化層和上層液去干凈，否則，取出的下層液往往不純。

2）在加樣時(shí)要注意所加樣品的準(zhǔn)確性。加樣不要太快，且要在微孔下1/3處注入，不要接觸微孔內(nèi)部，不要產(chǎn)生氣泡，更不能濺出。

3）溫育時(shí)的溫度會(huì)對(duì)結(jié)果造成極大的影響，室溫若是太高或太低，最好把酶標(biāo)板置于恒溫箱中進(jìn)行。

4）用洗液洗滌時(shí)最容易造成微孔間的交叉污染，因次，在甩板時(shí)動(dòng)作要干凈利索且不要用力太猛，以防液體飛濺污染，最后一次甩板后在吸水紙上把液體拍干時(shí)，板要垂直，且用力不可太猛。

[1]馬國(guó)軍，曲秋芝，吳文華，等.抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2001，14(1):73-76

[2]胡瑩瑩,李?lèi)?ài)，葉賽，等.高效液相色譜法與酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定海水中痕量氯霉素[J].分析試驗(yàn)室，2006，25(3)：112-114

[3]劉堃，高世同，吳麗明，等.定量ELISA法檢測(cè)蜂蜜中氯霉素殘留量研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生管理，2004，20(3)：265-26

[4]蔣定國(guó),楊大進(jìn).動(dòng)物性食品中氯霉素殘留檢測(cè)技術(shù)的研究概況(綜述)[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2002,14(2):44-47

[5]周正紅,鄧斌,林保銀.氯霉素類(lèi)抗生素殘留分析研究進(jìn)展[J].肉類(lèi)研究,2006(3):34-37

[6]Hao-Yu Shen,Hai-Liang Jiang.Screening determination and confirmation of chloramphenicol in seafood,meat and honey using ELISA,HPLC UVD,GC ECD,GC MS EI SIM and GCMS NCI SIM methods[J].Analytica Chimica Acta,2008，535(4)：33-41

[7]毛麗莎，劉紅河，劉桂華.動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留量的檢測(cè)方法研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，37(6)：1123-1125

[8]高茂根，楊瑞章，王太全，等.3種ELISA試劑盒檢測(cè)動(dòng)物產(chǎn)品中氯霉素殘留的應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45(9)：57-58

[9]劉麗麗.酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的影響因素及控制方法[J].齊魯漁業(yè)，2010，27(2)：7-9

Residues of Chloramphenieol in Aquatic Products by ELISA

XIE Qiu－ju，XU Jing，WANG Xiu－juan
（School of the Ocean，Harbin Institute of Technology at Weihai，Weihai 264209，Shandong，China）

The residues of Chloramphenieol in aquatic products of Weihai was detected by enzyme－linked immunoassay （ELISA），the results showed that the standard curve of Chloramphenieol is Y＝－30.05X＋37.35，R2＝0.995，the recoveries≥70.09%，the vast majority of 113 samples were not feeded Chloramphenieol except for a few samples.

ELISA；aquatic products；Chloramphenieol

解秋菊（1972—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品微生物。

2011-04-11