巴媛媛，樸美子，孟菡妍

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝的研究

巴媛媛，樸美子*，孟菡妍

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

為優(yōu)化瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時(shí)間、水料比3個(gè)因素為自變量，以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率為響應(yīng)值，使用BOX-Benhnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，優(yōu)化瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝，并確定瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的最佳工藝條件為：提取溫度80.99℃、提取時(shí)間2.13 h、水料比32.06∶1（mL/g）。在此條件下，實(shí)際提取率為10.49%，與預(yù)測(cè)值基本吻合。

瓦尼木層孔菌；多糖；提取工藝；響應(yīng)面分析

瓦尼木層孔菌（Phellinus vaninii Ljub），又名楊黃，隸屬擔(dān)子菌綱、非褶菌目、銹革孔菌科、木層孔菌屬[1]。瓦尼木層孔菌以生長(zhǎng)在天然林中老齡的楊樹(shù)上，且子實(shí)體孔口表面呈黃色、菌蓋邊緣為黃色帶狀環(huán)紋而得名[2]，人工林中很難找到。該菌具有抑制腫瘤、解毒、補(bǔ)腎、增強(qiáng)人體免疫力、防治癌癥等功效。近幾年，對(duì)瓦尼木層孔菌的馴化栽培已經(jīng)獲得成功[3-5]，但是關(guān)于瓦尼木層孔菌活性物質(zhì)提取的研究相對(duì)較少，尤其沒(méi)有與其多糖相關(guān)的報(bào)道。

本試驗(yàn)主要利用瓦尼木層孔菌液體發(fā)酵所得的菌絲體為原料，采用熱水浸提法提取菌絲體多糖[6-7]，用苯酚-硫酸法[8]測(cè)定多糖含量，以菌絲體粗多糖提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法[9-10]對(duì)瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為新型真菌多糖產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓦尼木層孔菌：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中韓食品生物技術(shù)研究所。

葡萄糖、無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮、濃硫酸、苯酚等（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

IS-RDH1恒溫振蕩器：美國(guó)精騏有限公司；SWCJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BCD-216YH海爾冰箱：海爾集團(tuán)；DU-800紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Beckman公司；分析天平：奧豪斯公司；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；YXQ-LS-SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精弘試驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；一列二孔電熱恒溫水浴鍋：龍口市先科儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的瓦尼木層孔菌菌絲體干粉→脫脂→熱水浸提→離心→上清液→脫蛋白→濃縮→醇沉→離心→沉淀→依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→60℃烘干→瓦尼木層孔菌菌絲體粗多糖

1.3.2 瓦尼木層孔菌菌絲體多糖含量的測(cè)定

用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)苯酚-硫酸法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.0181C+0.0006[C為葡萄糖質(zhì)量濃度，（μg/mL），A為吸光度]，R2=0.9999，線性范圍0～54μg/mL。同樣測(cè)定樣品提取液中多糖的吸光度，通過(guò)回歸方程計(jì)算瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的含量。

1.3.3 多糖提取率的計(jì)算

1.3.4 瓦尼木層孔菌菌絲體多糖水提工藝的優(yōu)化

試驗(yàn)選用提取溫度、提取時(shí)間和水料比對(duì)多糖提取率起主要影響的3個(gè)因素，以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素考察。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素見(jiàn)表1。

表 1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Variables and levels in responses surface design

試驗(yàn)共有15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為分析因子，3個(gè)為零點(diǎn)。零點(diǎn)試驗(yàn)3次，以估計(jì)誤差。數(shù)據(jù)用Design expert7.0程序進(jìn)行分析，并由此得出響應(yīng)面分析圖和方差分析表。進(jìn)而得出模型方程，通過(guò)對(duì)模型方程的分析，得出最佳的菌絲體多糖提取工藝條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溫度對(duì)瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率的影響

固定水料比20∶1（mL/g），提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)3次，以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的提取率為指標(biāo)，考察不同的提取溫度對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，在提取溫度小于80℃時(shí)，瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率隨溫度的升高而升高；當(dāng)溫度大于80℃以后，多糖提取率隨溫度的升高而降低，這可能是由于高溫條件下多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞的結(jié)果。因此，選擇提取溫度在80℃左右。

2.2 提取時(shí)間對(duì)瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率的影響

固定水料比20∶1（mL/g），提取溫度80 ℃，提取次數(shù)3次，以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的提取率為指標(biāo)，考察不同的提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，多糖提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先上升再下降的總體趨勢(shì)，但超過(guò)2 h時(shí)多糖提取率雖然有所增加但不明顯。并且提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分多糖分解從而造成損失，因此，選擇提取時(shí)間在2 h左右。

2.3 水料比對(duì)瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率的影響固定提取溫度80℃，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)3次，

以瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的提取率為指標(biāo)，考察不同的水料比對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，當(dāng)提取水料比為10∶1～30∶1（mL/g）時(shí)，隨著料水比增加其瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率逐漸增大，當(dāng)水料比大于30∶1（mL/g）時(shí)多糖提取率有逐漸下降，因此，選擇水料比在30∶1（mL/g）左右。

2.4 瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化為了擬合多元二次模型方程各項(xiàng)系數(shù)的最優(yōu)值，

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，對(duì)影響多糖提取率的關(guān)鍵因素進(jìn)行15組試驗(yàn)，其中12組為分析因子，3組為零點(diǎn)。零點(diǎn)試驗(yàn)3次，以估計(jì)誤差，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Process variables and levels in response surface design arrangement and experimental response values

通過(guò)對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)擬合，獲得多糖提取率對(duì)提取溫度、提取時(shí)間和水料比的多元回歸方程：

表 3 方差分析表Table 3 Variance analysis for yield of polysaccharises with various extraction conditions

由表3可知，試驗(yàn)所選用的模型高度顯著，擬合度好，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間具有高度的相關(guān)性（R2=0.9871）。

由表4的Prob>F值可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)結(jié)果的影響排序?yàn)椋核媳?提取溫度>提取時(shí)間。且模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為98.71%，說(shuō)明模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型是合適的。因此可以用該模型方程來(lái)分析和預(yù)測(cè)不同條件下瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率的變化。

圖4～圖6反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。比較3組圖可知，三因素對(duì)瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率都有顯著的影響，水料比（X3）的影響為最顯著，表現(xiàn)為等高線更為陡峭；提取溫度（X1）和提取時(shí)間（X2）次之，表現(xiàn)為等到線曲線較平滑，說(shuō)明兩者對(duì)響應(yīng)值影響較小。

表 4 回歸分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

2.5 回歸模型的驗(yàn)證

通過(guò)上述多元回歸方程優(yōu)化得出Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的編碼值分別為X1=0.1976，X2=0.2526，X3=0.4130，所對(duì)應(yīng)的瓦尼木層孔菌菌絲體多糖理論最佳提取條件為提取溫度80.99℃、提取時(shí)間2.13 h、水料比32.06∶1（mL/g）時(shí)，其提取率最高可達(dá)10.51%。根據(jù)此條件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得其抑制率最高可達(dá)10.49%，與理論值較為接近。結(jié)果證明，該模型準(zhǔn)確，適用于瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取工藝的優(yōu)化。

3 結(jié)論

本文在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化了瓦尼木層孔菌菌絲體多糖的提取條件，最終得出菌絲體多糖最佳理論提取條件為提取溫度80.99℃、提取時(shí)間2.13 h、提取水料比32.06∶1（mL/g）。在此條件下，其瓦尼木層孔菌菌絲體多糖提取率最高可達(dá)10.49%。與理論值10.51%較為接近。

[1]戴玉成，圖力古爾.中國(guó)東北野生食藥用真菌圖志[M].北京：科學(xué)出版社，2007：164-166

[2]胡偉，王春生，張晶.楊黃代用料栽培初探[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2007，86(1)：12-13

[3]劉作喜，王漢生，劉珊紅，等.楊黃栽培與管理技術(shù)[J].中國(guó)食用菌,2005,24(5):28-29

[4]范宇光，秦立武，吳秀玲，等.瓦尼木層孔菌及其人工栽培技術(shù)[J].中國(guó)食用菌，2009，28(2)：24-25

[5]李延生，趙婷，陳艷秋，等.瓦尼木層孔菌菌絲培養(yǎng)特性初探[J].食用菌,2008(4):7-8

[6]王鴻，鄧澤元，劉蓉，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化山蕗菜根多糖的提取工藝[J].食品科學(xué)，2010，31(2)：46-50

[7]高愿軍，張家泉，司俊娜，等.響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌多糖提取工藝[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30(6)：7-10

[8]Dubois M,Gilles K A,Hamition J K,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Anal Chem，1956,28(3):350-356

[9]Annadurai G,Shhhja R Y.Use of Box-Behnken design of experiments for the adsorption of verofix red using bionpolymer[J].Bioprocess engineering,1998,18：463-466

[10]Li Q，F(xiàn)u C.Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protrin[J].Food chemistry,2005,92(4):701-706

Study on Extraction Technology of Polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub

BA Yuan－yuan，PIAO Mei－zi*，MENG Han-yan
（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

In this study，optimum condition of extraction of polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub was optimized by response surface test.On the basis of single－factor test，the mathematical regression model was established on the dependent variable（extraction yield of polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub）and independent variables （extract temperature，extract time，water/material ratio）by Box－Benhnken center composite design and response surface methodology.The optimum extraction conditions were as follows：extract temperature 80.99 ℃，extract time 2.13 h，water/material ratio 32.06∶1 （mL/g）.Under these conditions，the yield of polysaccharides from Phellinus vaninii Ljub was 10.49%，consistent with the prediction value.

Phellinus vaninii Ljub；polysaccharides；extraction technology；response surface analysis

巴媛媛（1984—），女（漢），碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

*通信作者：樸美子（1966—），女（朝鮮），副教授，理學(xué)博士，研究方向：功能食品的開(kāi)發(fā)。

2011-06-24