張超，尹禮國，徐洲，魏琴

（宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

蕨根黃酮類化合物提取工藝研究

張超，尹禮國，徐洲，魏琴

（宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

探索蕨根黃酮類化合物的提取工藝。單因子試驗(yàn)表明，粉碎度、溶劑種類與濃度、浸提時間、溫度、液料比等因素對黃酮類化合物提取的影響明顯。正交試驗(yàn)表明，浸提溶劑濃度、浸提時間、溫度、液料比4個因素中，液料比對黃酮類化合物浸出率的影響最大，其次是乙醇的濃度、浸提溫度，提取時間對黃酮類化合物浸出率的影響最小。在70℃條件下，以70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇作為提取劑，液料比為25∶1，回流浸提120min，蕨根黃酮類化合物提取量達(dá)到54.12mg/g。

蕨根；回流浸提；黃酮類化合物

鳳尾蕨科植物蕨（Pteridium aquilinum L.）是多年生草本植物，主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶[1]。蕨根是蕨的根莖，蕨根除含有豐富的淀粉外[2]，還富含黃酮類化合物等生物活性物質(zhì)[3]。

黃酮類化合物是指具有C6-C3-C6基本結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，大部分是色原酮的衍生物，根據(jù)兩端苯環(huán)與中間三碳的連接方式、位置、直連或環(huán)及其氧化水平，衍生而成的一大類化合物。黃酮類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、保肝、止咳祛痰、抗氧化和雌激素樣的作用[4-8]。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，主要有黃酮和黃酮醇、二氫黃酮和二氫黃酮醇、異黃酮和二氫異黃酮、查耳酮和二氫查耳酮類、橙酮類、花色素和黃烷醇類、其他黃酮類七大類。因植物種類不同，其所含黃酮類化合物的組成成分也各不相同，性質(zhì)各異[9]。因此，提取不同植物的黃酮類化合物的方法及參數(shù)也有差異。本文探討了蕨根黃酮類化合物的提取方法和相關(guān)工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蕨根

采自宜賓學(xué)院校園內(nèi)。

1.1.2 化學(xué)試劑

乙醇、甲醇、石油醚（30℃～60℃）、乙醚：廣東汕頭市西隴化工廠；乙酸乙酯：天津市北方化玻采購銷售中心；丙酮：成都市聯(lián)合化工試劑研究所；濃鹽酸：德陽市孝泉師范化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉：重慶北碚精細(xì)化工廠；三氯化鋁、亞硝酸鈉：天津市科密化學(xué)試劑開發(fā)中心；硝酸鋁：天津市福晨化學(xué)試劑廠；標(biāo)準(zhǔn)蘆?。?5%）：成都超人植化有限責(zé)任公司。以上試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

維嘉小型粉碎機(jī)：中山市宏威五金電器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生華儀器有限公司；SHBB95型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州市長城科工貿(mào)有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇醫(yī)療器械廠；紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子天平：北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蕨根粉的制備

將蕨根淘洗除去泥土等雜質(zhì)，置于干燥箱中60℃干燥至恒重，粉碎，篩得20、40、60、80、120、140目蕨根粉，用塑料袋密封保存于暗箱內(nèi)并及時處理。

1.2.2 總黃酮含量的測定[10]

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)液與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥（60℃、0.09 MPa）至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.077 g，用60%乙醇溶解，定容至250 mL，搖勻，得濃度為0.2926 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，放置于低溫暗箱內(nèi)，及時檢測。

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，用60%乙醇添至10 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，6 min后加入4%NaOH10 mL，混勻，再用60%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后在波長510 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

1.2.2.2 樣品液制備與樣品總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確稱取1.0 g恒干蕨根粉，用濾紙包好，放入抽提器中，用40 mL 95%的乙醇，在90℃條件下回流浸提至回流液呈無色，用乙醇洗滌接收瓶2次～3次。合并提取液與洗滌液，定容為適當(dāng)濃度的樣品液。

準(zhǔn)確吸取1 mL樣品液置于25 mL容量瓶中，用60%乙醇添至10 mL，其它操作同1.2.2.1，測得吸光度A。

式中：M為樣品質(zhì)量，g；V為定容容積，mL；C為樣品液的總黃酮濃度，（mg/mL）。

1.2.3 蕨根黃酮顏色反應(yīng)[11]

1.2.3.1 HCl-Mg顯色反應(yīng)

取樣品液5 mL于試管中，加入少許鎂粉，輕搖混勻，再加入1 mL濃鹽酸，觀察顏色變化。該實(shí)驗(yàn)以供試液中僅加入濃鹽酸作空白對照。

1.2.3.2 與4%NaOH水溶液的反應(yīng)

取樣品液5 mL于試管中，加入1 mL 4%NaOH水溶液，輕搖混勻，觀察顏色變化。

1.2.3.3 與AlCl3顯色反應(yīng)

取樣品液5mL于試管中，加入1%AlCl3水溶液2mL，輕搖混勻，觀察顏色變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 蕨根黃酮類化合物的顏色反應(yīng)

將1.2.2.2獲得的樣品液分別與HCl-Mg、NaOH、AlCl3的起顯色反應(yīng)，結(jié)果如表1所示。

表 1 蕨根乙醇粗抽物的顏色反應(yīng)結(jié)果Table 1 Colour reaction results of ethanol crude extracts from fern root

從表1可以看出，蕨根的乙醇提取液與HCl-Mg、NaOH、AlCl3反應(yīng)分別顯深紅色、深黃色、亮黃色，符合黃酮類化合物與這些試劑反應(yīng)的顯色特性，說明蕨根提取物中有黃酮類化合物存在；綜合3個顏色反應(yīng)特征和不同黃酮類化合物的顯色性質(zhì)，可以初步判斷蕨根黃酮類化合物以黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類化合物為主要組分。

2.2 提取劑種類對蕨根黃酮類化合物提取的影響

精確稱取多份2.5 g粉碎度為100目的蕨根粉，分別加入水、甲醇、乙醇（95%）、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（30℃～60℃）各100 mL，在溶劑沸點(diǎn)溫度下，回流浸提3 h，抽濾、洗滌、定容，測定黃酮類化合物含量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，實(shí)驗(yàn)的幾種溶劑對蕨根黃酮類化合物提取能力的大小順序是：甲醇>乙醇>丙酮>水>乙酸乙酯>石油醚。分析原因可能與蕨根中黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)有關(guān)。因?yàn)檐蘸蛙赵?、單糖苷、雙糖苷或三糖苷等在不同的溶劑中有不同的溶解度。從蕨根黃酮類化合物在甲醇、乙醇中浸出率較高，在丙酮、乙酸乙酯、石油醚中浸出率較低的事實(shí)，結(jié)合黃酮、黃酮醇、查耳酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇等的性質(zhì)，可以推測，蕨根黃酮類化合物中黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類的含量相對較高。雖然甲醇的浸出率略高于乙醇，但由于甲醇有毒，所以，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取劑。

2.3 粉碎度對蕨根黃酮類化合物提取的影響

精確稱取2.5 g不同粉碎度的蕨根粉，用100 mL 95%的乙醇，在溶劑沸點(diǎn)溫度條件下，回流浸提3 h，抽濾、洗滌、定容，分別測定黃酮類化合物的含量，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，粉碎度不同，蕨根黃酮提取量有很大的差異。粉碎度在20目～80目之間時，隨粉碎度的增加，黃酮類化合物的浸提量增加；當(dāng)粉碎度超過80目后，進(jìn)一步提高粉碎度，黃酮類化合物的提取量增加不明顯。分析原因，可能與黃酮類化合物存在于蕨根的特定組織有關(guān)。隨粉碎度的增加，更多的組織結(jié)構(gòu)被破壞，其黃酮類化合物能被溶劑更多地提取出來，但當(dāng)粉碎達(dá)到一定程度后，進(jìn)一步提高粉碎度，提取量不表現(xiàn)為繼續(xù)增加。

2.4 乙醇濃度對蕨根黃酮類化合物提取的影響

精確稱取多份2.5 g的80目蕨根粉，以不同濃度乙醇為提取劑，在沸點(diǎn)溫度條件下，回流浸提3 h，抽濾、洗滌、定容，分別測定黃酮類化合物的含量，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，不同乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)）條件下，蕨根黃酮類化合物的浸提率差異較大。當(dāng)乙醇濃度為40%～70%（體積分?jǐn)?shù)）時，黃酮類化合物的浸出率隨乙醇濃度的增加而提高；乙醇濃度70%（體積分?jǐn)?shù)）時，提取率最高；超過70%（體積分?jǐn)?shù)）時，隨乙醇濃度增加黃酮類化合物浸提率略有降低。分析原因，可能與蕨根黃酮類化合物中既含有苷，又含有一定量的苷元有關(guān)。因?yàn)樵诓煌瑵舛鹊囊掖既芤褐兴鸵掖嫉南鄬渴遣煌?，苷和苷元在不同濃度的乙醇溶液中有不同的浸出特性；在乙醇濃度?0%（體積分?jǐn)?shù)）左右時，苷和苷元被浸提出的總量較高。提高乙醇濃度，浸提率因苷的溶解度降低而降低。鑒于此，后續(xù)研究選擇了70%乙醇溶液為提取劑。

2.5 浸提時間對蕨根黃酮類化合物提取的影響

精確稱取多份2.5 g的80目蕨根粉，以70%的乙醇溶液為提取劑，在沸點(diǎn)溫度下，分別回流浸提不同時間，抽濾、洗滌、定容，測定黃酮類化合物的含量，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?，浸提時間在120 min以內(nèi)，隨提取時間的增加，黃酮類化合物的浸出量也隨之增加。當(dāng)浸提時間超過120 min后，蕨根黃酮類化合物的浸出量增加不明顯。浸提超過150 min后，黃酮類化合物量略有降低。分析原因可能與黃酮類化合物中的某些組分在試驗(yàn)溫度下分解損失，或與浸提時間延長，淀粉糊化量增加而阻礙了部分黃酮類化合物被浸提出來有關(guān)。

2.6 浸提溫度對蕨根黃酮類化合物提取的影響

精確稱取多份2.5 g的80目蕨根粉，加入70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇為提取溶劑，分別在25（室溫）、40、50、60、70、80、90℃條件下回流浸提120 min，抽濾、洗滌、定容，分別測定黃酮類化合物的含量，結(jié)果如圖6所示。

從圖6可以看出，溫度低于70℃，隨溫度的升高，黃酮類化合物的浸出率提高；25℃（室溫）時蕨根黃酮類化合物浸出率最低，70℃時黃酮類化合物的浸出率最高。當(dāng)溫度超過70℃后，其浸出率隨溫度升高而略有下降。分析原因，可能與在一定溫度范圍內(nèi)升高溫度有利于提高黃酮類化合物溶解度有關(guān)；但當(dāng)溫度超過70℃后，可能因淀粉部分糊化阻礙黃酮類化合物浸出，或因部分熱不穩(wěn)定成分受熱被破壞有關(guān)。

2.7 液料比對蕨根黃酮類化合物提取的影響

精確稱取多份2.5 g 80目蕨根粉，分別按液料比（mL∶g） 為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加入70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，在70℃條件下回流浸提120 min，抽濾、洗滌、定容，測定黃酮類化合物的含量，結(jié)果如圖7所示。可以看出，隨液料比從10∶1（mL∶g）增加為25∶1（mL∶g），黃酮類化合物的浸出率明顯增加；超過25∶1（mL∶g）后浸出率增加緩慢。分析原因可能與蕨根中黃酮類化合物含量較高，而在溶劑內(nèi)的溶解度又有限有關(guān)。當(dāng)溶劑用量在一定范圍內(nèi)增加時，黃酮類化合物的浸出量增大，浸出率增加。但當(dāng)溶劑用量增加到一定程度后，蕨根中黃酮類化合物幾乎已全部溶出，此時增加溶劑用量不能進(jìn)一步提高浸出率。因此，選擇適當(dāng)?shù)囊毫媳葘μ岣咿ЦS酮的浸出率和減少溶劑用量有著重要的意義。

2.8 正交試驗(yàn)

在乙醇濃度、液料比、浸提溫度、浸提時間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，選擇單因子試驗(yàn)結(jié)果較好的參數(shù)，設(shè)計了正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表 2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

從正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，極差RA>RB>RD>RC，液料比對蕨根黃酮類化合物浸出率的影響最大，其次是乙醇的濃度、提取的溫度值，提取時間對黃酮浸出率的影響最小。乙醇回流浸提蕨根黃酮類化合物的最佳浸提條件為A2B2C1D2。即液料比為25∶1（mL/g），提取溫度為70℃，提取時間為120 min，乙醇濃度為70%。在此條件下，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，蕨根中黃酮類化合物的含量為54.12 mg/g。

3 結(jié)論

1）綜合蕨根黃酮類化合物的顯色反應(yīng)、溶劑種類與濃度對其黃酮類化合物的影響，可以初步推測蕨根黃酮類化合物主要以黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類化合物等為組分。

2）將蕨根粉碎到過80目篩是黃酮類化合物提取時適宜的粉碎度；甲醇和乙醇是較好的蕨根黃酮類化合物提取劑。

3）在乙醇濃度、浸提時間、浸提溫度、液料比4個因素中，液料比對蕨根黃酮類化合物浸出率的影響最大，乙醇濃度、提取溫度次之，提取時間對黃酮類化合物的浸出率影響最小。在溫度為70℃條件下，以70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液為提取劑，液料比25∶1（mL/g），回流浸提120 min，蕨根黃酮類化合物提取量達(dá)到54.12mg/g。

[1]陳心啟.中國植物志:三卷1分冊[M].北京:科學(xué)出版社,1990:240-241

[2]孟凡冰,陳戀,鐘耕,等.蕨根淀粉的組分分離和純化研究[J].中國糧油學(xué)報，2011,26(1):56-60

[3]張帆.蕨菜的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2004,16(2):121-123

[4]匡海學(xué).中藥化學(xué)專論[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:339-340

[5]宋曉凱.天然藥物化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:74-77

[6]Dave Oomah B.Flavonoids and antioxidative activities in buckwheat[J].J Agric Food Chem，1996(44):1746-1750

[7]Del Rio J A,et al.Effects of flavonoids on thermal autoxidation of palm oil，structure-activity relationships[J].J Agri food Chem，1998(46):4423-4428

[8]Mitsuru Watanabe.Catchins as antioxidants from Buckwheat（FagopyrumesculentumMoench）Groats[J].J Agric Food Chem，1998(46):839-845

[9]劉湘,汪秋安.天然產(chǎn)物化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:71-83

[10]尹禮國.苦蕎黃酮的提取純化及其抗氧化性的研究[D].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文,2003:18-20

[11]肖崇厚.中藥化學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1996:276-279

Study on Extraction of Flavonoids from Fern（Pteridium aquilinum L.） Root

ZHANG Chao，YIN Li－guo，XU Zhou，WEI Qin
（College of Life Science and Food Engineering，Key Laboratory of Fermentation Resource and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，Yibin University，Yibin 644000，Sichuan，China）

The extraction of flavonoids from fern （Pteridium aquilinum L.）root was carried out.The singlefactor experiments indicated that grinding degree，extractant kinds and concentration，extracting time，extracting temperature and liquid－solid ratio had much effect on the extraction of flavonoids.The orthogonal experiments showed that the respective effects of liquid －solid ratio，ethanol concentration，extracting temperature and extracting time on the leaching rate of flavonoids decreased progressively among the four factors.The extraction amount of flavonoids from fern （Pteridium aquilinum L.）root came to 54.12 mg/g under the following conditions 70%ethanol（volume fraction） as extractant，the ratio of liquid －solid 25 ∶1，temperature 70℃，and extracting time 120 min.

fern（Pteridium aquilinum L.）root；refluxing extraction；flavonoids

宜賓市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目（200801007）

張超（1966—），男（漢），副教授，碩士研究生，主要從事生物工程與食品生物技術(shù)研究。

2011-08-01