肖厚榮，楊紅，王中風(fēng)，翟偉華

（合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽 合肥 230022）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，由Mann和Keilin于1938年首次從牛紅細胞中分離得到，為一種藍色含銅蛋白質(zhì)。1969年McCord和Fridovich發(fā)現(xiàn)該蛋白具有催化O2-·發(fā)生歧化反應(yīng)的功能，故將此酶命名為超氧化物歧化酶[1]。其主要作用是清除超氧陰離子自由基（O2－·）[2]，是一種具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射和消炎作用的藥用酶[3]，在食品、醫(yī)藥、保健品、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[4-7]。

動物SOD研究主要集中在肝臟和血液，植物SOD則主要集中在仙人掌和煙草等。目前，已建立了從動物血紅細胞中分離純化SOD的多種方法[8-10]，然而，從動物肝臟中提取SOD的技術(shù)尚在探討中。本試驗以豬肝為原料提取SOD，并對工藝技術(shù)參數(shù)進行優(yōu)化，參考有關(guān)文獻[11-14]，運用多重線性回歸的方法研究多個自變量與蛋白的比活力是否存在某種線性關(guān)系或非線性關(guān)系，建立多重回歸方程；同時對純化獲得的SOD進行了初步表征。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肝：購自安徽省合肥市黃山路菜市場。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市化學(xué)試劑三廠；磷酸氫二鉀：上海恒信化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀：廣東西隴化工廠；鹽酸：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷：Tris，BR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）：上海生化所申華生化公司，以上試劑均為分析純。

1.2.2 儀器

JJ-2組織搗碎勻漿機：常州國華電器有限公司；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；20000轉(zhuǎn)式離心機：德國進口；BSZ-160型自動部分收集器、HL-Z恒流泵：上海瀘西分析儀器廠；Z型系列層析柱：上海錦華實驗器械廠；Libra S22型紫外分光光度計：英國 Biochrom；Agilent1100液相色譜系統(tǒng)：Agilent,USA；Aeomscan Advantage電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES）：Thermo Jarrell Ash Corporation,USA。

1.3 方法

1.3.1 SOD的酶活力及蛋白質(zhì)含量的測定

1.3.1.1 測定酶活時鄰苯三酚用量的確定

在10 mL試管中加入4.50 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液（50 mmol/L，pH 8.3），在（25±0.5）℃的恒溫水浴中保溫10 min，然后加入50 mmol/L鄰苯三酚溶液（25±0.5）℃（空白管用10mmol/LHCl代替），迅速搖勻倒入1 cm比色皿中，以空白管為參比，在325 nm下，每隔30s測1次吸光度值，連續(xù)記錄3min。調(diào)節(jié)鄰苯三酚溶液用量，將其自氧化速率控制在0.070（±0.002）D/min，此值即為測酶活時鄰苯三酚溶液的用量。

1.3.1.2 SOD酶活力的測定

酶活力單位定義：在25℃恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。

如上步驟，加入鄰苯三酚溶液（25±0.5）℃9 μL（空白管用10 mmol/L HCl代替），迅速搖勻倒入1 cm比色杯中，以空白管為參比，在325 nm下，每隔30 s測1次吸光值，連續(xù)記錄3min，調(diào)節(jié)樣液體積，使樣液中連苯三酚的氧化速度控制在0.035（±0.002）D/min，并記錄樣液體積。

其中：A1為自氧化速率；A2為樣液氧化速率；V總為反應(yīng)液總體積；N為樣液稀釋倍數(shù)；V樣為樣液體積。

1.3.1.3 蛋白質(zhì)含量的測定

采用紫外分光光度計法。

1.3.2 超氧化物歧化酶的提取與分離純化

豬肝500 g，加入500 mL 1.2%KCl溶液后勻漿，離心15 min（10000 r/min），其上清液水浴升溫至一定溫度并保持固定時間，冷卻，離心20 min（11000 r/min），棄去沉淀；在4℃下向上清液中加入冷丙酮，放置過夜；離心30min（13000r/min，4℃），棄上清液，沉淀即為SOD。

在對熱變性時間、熱變性溫度、丙酮用量和提取的鹽濃度等單因素進行探討的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計方法以酶的比活力為指標對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

粗提獲得的SOD經(jīng)Sephadex G-200進一步純化。層析柱規(guī)格為Ф26×100（mm），洗脫液為0.05 mol/L NaCl，流速為 12 mL/h，每管收集 4 mL。

1.3.3 超氧化物歧化酶的檢測與表征

1.3.3.1 SOD純度及分子量測定

標準蛋白質(zhì)和純化得到的SOD在同一條件下進行SDS-PAGE，根據(jù)相對遷移率可直接在標準曲線上求出分子量，同時可以獲得蛋白質(zhì)純度信息。

為進一步驗證蛋白質(zhì)是否達到單一組分的純度，使用高效液相色譜對純化得到的SOD進行檢測。色譜條件：Zorbax SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Agilent，USA）；流動相：pH 8.30 的 50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液（超純水配制）；流速:1.0 mL/min，紫外檢測波長：254 nm，280 nm；柱溫:30℃；進樣量：500 μL。

1.3.3.2 紫外-可見光譜與電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜

1）紫外-可見光譜

純SOD粉末溶于去離子水，在190 nm～700 nm范圍內(nèi)進行掃描，測定它的最大吸收波長。

2）金屬離子測定及類別鑒定

在1.8 mg純SOD（預(yù)先在50℃條件下干燥24 h）中加入10 mL 0.02 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.0），所得酶液裝入透析帶（半透膜）在去離子水中透析至電導(dǎo)不再變化。處理后的樣品用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀測金屬離子的種類和含量。

1.3.3.3 SOD的酶學(xué)性質(zhì)

以鄰苯三酚為底物，改變反應(yīng)體系緩沖液的溫度、pH，分別測定SOD的最佳反應(yīng)溫度和最佳pH，并通過雙倒數(shù)法測定該酶的Km值和Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 超氧化物歧化酶的提取與分離純化

2.1.1 超氧化物歧化酶提取條件的優(yōu)化

在前期單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用L9（34）設(shè)計來優(yōu)化酶的提取與分類純化條件，以SOD的比活力為衡量標準。試驗結(jié)果見表1。

表1 正交試驗表Table 1 Orthogonal test

對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如表2所示。

表2 方差分析表Table 2 Tests of Between-Subjects Effects

以上方差分析表明4個因素的P值均小于0.001，差異極顯著，故對試驗中的A、B、C、D四因素采用SN-K法進行多重比較，誤差均方=167.1，調(diào)和樣本容量=6.0,α=0.05，結(jié)果見表1所示。

由表1多重比較和極差R可知：因素的影響大小依次為：A>C>D>B。A因素的3個不同水平間差異均顯著。試驗中觀察到，當熱變性溫度為50℃和60℃的時候，所沉淀的雜蛋白明顯少于70℃時的量。而酶活測定則表明，熱變性溫度為70℃所得SOD的比活力及總活力均高于其他兩組。故本試驗中，SOD提取的熱變性溫度為70℃。

B因素為20 min的這一組與其他兩組相比，差異顯著；而熱變性時間為10 min和30 min的這兩組間，差異不顯著。試驗發(fā)現(xiàn)，SOD酶比活力隨時間的延長呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢；30 min組的比活力雖大于10 min的組，但這兩組從統(tǒng)計學(xué)上檢驗差異不顯著，故從節(jié)能的角度考慮，選擇熱變性時間為10 min。

C因素為1.4和1.8這兩組相比，差異不顯著，但這兩組與1.6倍體積的相比，差異均顯著，且1.6組所得的SOD的比活力比其他兩組均大。

丙酮用量對SOD的比活力的影響較大，SOD的比活力隨著丙酮用量的增大，剛開始出現(xiàn)增加的趨勢，但當丙酮用量超過1.6倍體積時，SOD的比活力卻出現(xiàn)下降的趨勢。從生物統(tǒng)計角度來講，丙酮用量為1.6倍體積的這一組與其他兩組結(jié)果差異顯著。綜合考慮節(jié)約成本和所得產(chǎn)品比活力，本實驗丙酮用量為1.6倍體積。

D因素為1%，1.2%和1.4%這三組相比，差異均顯著。試驗發(fā)現(xiàn)，當鹽濃度為1.4%的時候，所得到的SOD的比活力高于其他兩組。同時，從統(tǒng)計學(xué)的角度來說，鹽濃度為1.4%的這一組與其他兩組結(jié)果差異顯著。所以，在本試驗的范圍內(nèi)，SOD提取的最佳鹽濃度為1.4%。

故本試驗方案的最佳組合為A3B1C2D3。即：熱變性溫度為70℃，熱變性時間為10 min，丙酮用量為1.6倍體積，鹽濃度為1.4%。

2.1.2 SOD的純化、純度鑒定與分子量測定

2.1.2.1 SOD的純化

粗提獲得的SOD經(jīng)Sephadex G-200柱層析純化，其收集液逐管測定酶活和波長280 nm處吸光度。以吸光度為縱坐標、以管數(shù)為橫坐標作圖，結(jié)果見圖1。

圖1顯示，共有4個蛋白峰。酶活測定結(jié)果顯示，第3個峰顯示SOD酶活性。

2.1.2.2 SOD中金屬離子種類與含量

紫外-可見光譜結(jié)果顯示豬肝SOD的紫外最大吸收波長為255nm（見圖2），而不是一般蛋白的280 nm，這表明該酶為Cu，Zn-SOD，因為Cu，Zn-SOD的明顯特征為最大紫外吸收在250 nm～270 nm，與文獻報道的茶葉、鴨血中的Cu，Zn-SOD最大紫外吸收波長在265.4 nm和258 nm相符。

圖1 Sephadex G-200色譜分離Fig.1 Chromatography of Sephadex G-200

圖2 SOD紫外吸收光譜Fig.2 UV Spectra of the purified SOD from liver

ICP-MS分析結(jié)果進一步證實，分離純化得到的SOD含銅鋅元素，且銅離子、鋅離子、蛋白質(zhì)分子的比例為 1∶1∶1。

2.1.2.3 SOD分子量的測定

圖3 Cu，Zn-SOD的SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE of Cu,Zn-SOD from liver

純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、染色后為一條電泳帶，說明純化后的SOD酶為均一蛋白質(zhì)。根據(jù)標準蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果作對數(shù)分子量相對遷移率曲線，計算得該Cu，Zn-SOD酶的對數(shù)分子量為32 ku，而Cu，Zn-SOD酶是由2個相同亞基組成[15-16]，單一條帶的分子量約為16 ku。這一試驗結(jié)果與蘇昕[16]等報道酵母SOD結(jié)果相吻合。

純化得到的SOD液相色譜檢測結(jié)果見圖4。

圖4 SOD的HPLC譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of SOD from liver

由圖4可見，SOD的HPLC譜圖出現(xiàn)了單一的對稱峰，圖中橫坐標為流動相的體積，流動相的流速為1 mL/min。可以看出，該酶的純度較高。由此可見，HPLC與SDS-PAGE的結(jié)果是吻合的。

2.2 SOD的酶學(xué)和理化性質(zhì)

2.2.1 溫度對SOD活力的影響

溫度對SOD酶活性的影響見圖5。

圖5 溫度對SOD活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of SOD

由圖5可以看出，30℃以下時，SOD的活力隨溫度的升高而增高，30℃時，SOD的活力最高，當溫度超過30℃后，SOD的活力隨著溫度的升高迅速下降，降幅較大（p＜0.01）。相關(guān)學(xué)者[17]從煙草中分離純化得到SOD的3種同功酶，其中Cu-Zn-SODⅠ的最適溫度為30℃，Cu-Zn-SODⅢ的最適溫度約為40℃。

2.2.2 pH對SOD活力的影響

圖6 pH對SOD活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of SOD

pH對SOD活力的影響見圖6?？梢钥闯?，pH對SOD活性的影響較大，pH7.3以下時，SOD活力較低，隨著pH的升高，SOD活力逐漸增高，且增幅較大，pH7.3時活力最高；當pH超過7.3后，SOD活力隨著pH的升高又迅速降低。在pH 6.5～9.0的范圍內(nèi)，SOD具有較高的活力，表明SOD的最適pH范圍是pH 6.5～9.0。劉劍利[18]等報道利用金屬螯合親和層析法純化的玉米SOD的pH穩(wěn)定范圍是pH6～10之間，與本研究結(jié)果相吻合。

2.2.3 SOD Km值和Vmax的測定

圖7 雙倒數(shù)作圖曲線Fig.7 Lineweaver-Burk

使用雙倒數(shù)作圖法，以1/[S]為橫坐標，1/△A325為縱坐標使用Origin進行作圖，得到一條直線，直線與X軸的截距為1/Km，與Y軸的截距為1/Vmax，從而得到Km=1.574、Vmax=0.268。

3 結(jié)論

1）以豬肝為原料，通過抽提液加熱、丙酮沉淀和Sephadex G-200層析柱色譜提取、純化，可以得到單一組分的 Cu，Zn-SOD。

2）最佳的提取條件是：在1.4%的鹽濃度下，于70℃水浴中熱變性10 min，然后加1.6倍體積的丙酮獲得SOD粗沉淀。

3）紫外-可見吸收光譜和ICP-MS分析結(jié)果均表明得到的是含銅、鋅的SOD，即Cu，Zn-SOD，且銅離子、鋅離子、蛋白質(zhì)分子的比例為 1∶1∶1。

4）豬血Cu，Zn-SOD分子量為32 ku，由2個相同亞基組成，單一條帶的分子量約為16 ku。

5）豬血 Cu，Zn-SOD 最適為 pH7.3，最適溫度為30℃。

6）以鄰苯三酚為底物，該酶的Km值為1.574，Vmax為0.268。

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