余炳取 賈 杰 張益光 吳炳權(quán) 孟凡升 鄭娟紅

（浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

急性胰腺炎 （AP）時(shí)常伴有血清細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的升高，且升高幅度與急性胰腺炎嚴(yán)重程度呈正比，能導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）和多器官功能衰竭（MOSF）。腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的移居參與了ANP繼發(fā)感染和SIRS的發(fā)生，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)變化應(yīng)有利于控制腸道細(xì)菌和毒素的移居，對(duì)AP起到保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究探討生大黃聯(lián)合微生態(tài)制劑對(duì)重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）及其胰腺病理組織學(xué)改變的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠64只，雌雄不分，體質(zhì)量180～220 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試藥與儀器 生大黃 （三九醫(yī)藥），培菲康 （上海信誼藥廠）。左旋精氨酸（Sigma公司），TNF-α、IL-10放射免疫分析試劑盒（bender公司），DFM-96型多管放射免疫計(jì)數(shù)管（聯(lián)機(jī)）（合肥眾成機(jī)電技術(shù)公司）。

1.3 分組及造模 將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，生大黃組，生大黃聯(lián)合培菲康組（聯(lián)合組），每組16只。大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，用10%左旋精氨酸溶液按1 g/kg腹腔注射制作SAP大鼠模型，術(shù)后禁食不進(jìn)水。模型組和治療組全部造模成功。

1.4 給藥 正常對(duì)照組及模型組大鼠于術(shù)后3 h后予0.85%氯化鈉灌胃（1 mL/100 g體質(zhì)量）；生大黃組在造模3 h后胃管注入（1 mL/100 g體質(zhì)量）中藥液1次；聯(lián)合組在造模3 h后胃管注入中藥液基礎(chǔ)上同時(shí)加培菲康溶液灌胃，1×107CFU/d。

1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè) 各組灌胃均12 h 1次，并于12、24、48、72 h分批處死。（1）將大鼠麻醉后于腹主動(dòng)脈采血2 mL，在室溫下離心（2500 r/min，10 min），取血清在-20℃保存，血清 TNF-α、IL-10水平用ELISA方法檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)要求操作。（2）取部分新鮮胰腺組織，用濾紙拭除血跡后稱濕質(zhì)量，后置于60℃烤箱內(nèi)烘烤48 h，稱干質(zhì)量，以胰腺濕/干質(zhì)量比反映胰腺水腫程度。按Rongione［1］的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)以水腫、炎癥、出血和壞死評(píng)價(jià)胰腺組織損傷的程度，各項(xiàng)最低分為0分，最高分為4分，取各項(xiàng)積分之和評(píng)價(jià)胰腺的病理組織學(xué)改變。（3）并取2塊新鮮胰腺組織標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋行HE染色，觀察胰腺的病理改變，每張切片觀察20個(gè)視野。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，以單因數(shù)方差分析對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清TNF-α、IL-10水平的比較 見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清TNF-α水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），生大黃組和聯(lián)合組大鼠血清TNF-α水平低于模型組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清IL-10水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；生大黃組血清IL-10水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且聯(lián)合組明顯高于生大黃組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組血清TNF-α、IL-10水平及胰腺濕/干質(zhì)量比比較（）

表1 各組血清TNF-α、IL-10水平及胰腺濕/干質(zhì)量比比較（）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)合組比較，△P＜0.05。下同。

n TNF-α（ng／L）16 238.26±26.82**模型組 46.03±11.00 0.78±0.09組 別 IL-10（ng／L） 胰腺濕/干質(zhì)量比正常對(duì)照組 35.64±2.30* 0.60±0.15*16 274.96±18.87生大黃組 16 260.35±17.61 34.89±9.12**△ 0.61±0.17*聯(lián)合組 16 261.33±31.50 43.56±6.22 0.70±0.05*

2.2 各組胰腺濕/干質(zhì)量比 與正常對(duì)照組相比，模型組、生大黃組和聯(lián)合組大鼠胰腺濕/干質(zhì)量比均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而生大黃組和聯(lián)合組明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 各組胰腺病理組織學(xué)改變及評(píng)分 肉眼觀察，正常對(duì)照組胰腺外觀正常；模型組可見(jiàn)胰腺質(zhì)地偏硬，大網(wǎng)膜、腸系膜及腎脂肪囊可見(jiàn)皂化斑，胰腺與周?chē)M織粘連，可見(jiàn)水腫、出血和壞死灶，腹腔有中量血性腹水；治療組大鼠胰腺腫脹明顯，質(zhì)地尚軟，部分可見(jiàn)黃色壞死灶，腹腔有少量血性腹水。顯微鏡下：正常對(duì)照組胰腺組織正常；模型組胰腺腺泡小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，小葉間隙增大，可見(jiàn)小葉分隔，胰腺組織大片出血、凝固性壞死及脂肪壞死，可見(jiàn)血管破裂出血，壞死區(qū)見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，符合重癥胰腺炎病理改變；生大黃組和聯(lián)合組較模型組炎癥明顯減輕，表現(xiàn)為胰腺間質(zhì)水腫仍明顯，小葉間隙增大，可見(jiàn)小葉分隔，伴中量至大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡腫脹，胰腺組織壞死范圍縮小，可見(jiàn)凝固性或脂肪壞死，其中聯(lián)合組炎癥減輕更明顯。見(jiàn)圖1。各組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分見(jiàn)表2。

3 討 論

圖1 各組胰腺病理組織學(xué)切片（HE，×400）

表2 各組胰腺組織病理評(píng)分值（分，）

表2 各組胰腺組織病理評(píng)分值（分，）

炎癥 出血0** 0**模型組壞死 積分正常對(duì)照組 0** 0**組 別 水腫0**3.61±0.52 3.61±0.52 1.93±0.52生大黃組 3.34±0.52* 2.15±0.62* 1.38±0.52* 1.62±0.52* 8.49±0.68*聯(lián)合組 3.14±0.52* 2.01±0.60* 1.25±0.52* 1.52±0.52* 7.94±0.58*21.62±0.52 11.23±1.40

SAP是一種伴有全身多器官功能障礙的疾病，起病急驟，病情危重，并發(fā)癥多。IL-10是機(jī)體內(nèi)諸多抗炎細(xì)胞因子中最重要的多功能調(diào)節(jié)因子，有利于促炎。抗炎細(xì)胞因子平衡和炎癥的恢復(fù)，是目前所發(fā)現(xiàn)的AP時(shí)重要的強(qiáng)效抗炎細(xì)胞因子，在阻止胰腺持續(xù)壞死，AP的早期診斷、治療及預(yù)防中均起到了關(guān)鍵的作用［2］。隨著研究的不斷深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者更加注重保護(hù)機(jī)體防御功能和調(diào)節(jié)機(jī)體適度反應(yīng)在抗感染治療中的地位。近年來(lái)臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的移居參與了ANP繼發(fā)感染和SIRS的發(fā)生，其主要的原因?yàn)槟c黏膜的損傷和腸道細(xì)菌過(guò)度繁殖所造成的菌群紊亂、腸道動(dòng)力紊亂、細(xì)胞因子過(guò)度生長(zhǎng)、生長(zhǎng)因子缺乏和腸黏膜上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡而致使腸黏膜屏障損傷，發(fā)生腸道衰竭。因此調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)變化應(yīng)有利于控制腸道細(xì)菌和毒素的移居。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AP病機(jī)為氣滯濕阻、瘀凝不通、郁久化熱、濕熱搏阻中焦，以理氣攻下、清熱解毒為治則，運(yùn)用生大黃等中藥用于治療SAP已成為我國(guó)獨(dú)有的SAP綜合治療的重要組成部分，但其具體作用機(jī)制尚不明確。有學(xué)者認(rèn)為［3］，生大黃抑制胰酶活性，抑制巨噬細(xì)胞過(guò)度激活及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減少炎性細(xì)胞因子及自由基的釋放，還抑制血管通透性，松弛膽道口括約肌，維護(hù)腸管屏障功能，免除腸菌移位；可有效改善大鼠急性出血性胰腺炎的嚴(yán)重程度。

培菲康即雙歧桿菌、嗜乳酸桿菌和腸球菌三聯(lián)活菌，服用后分別定植在腸道的上、中、下部位，組成了一個(gè)在不同條件下都能生長(zhǎng)、作用快而持久的聯(lián)合菌群，在整個(gè)腸道黏膜表面形成一道生物屏障，防止致病菌侵襲，抑制有害菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素和致癌物質(zhì)。給藥后，通過(guò)重建宿主腸道菌群間的微生態(tài)平衡，抑制場(chǎng)內(nèi)有害菌及其產(chǎn)生的各種有害物質(zhì)，清除自由基及過(guò)氧化脂質(zhì)。陳磊等［4］ANP豬模型表明早期腸內(nèi)免疫微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)能有效減輕內(nèi)毒素血癥，降低NF-κB活性及細(xì)胞因子濃度，維持促抗炎反應(yīng)平衡。腸內(nèi)免疫微生態(tài)［5］營(yíng)養(yǎng)，可以補(bǔ)充腸道正常菌群，減少細(xì)菌易位，減少內(nèi)毒素血癥及炎癥因子的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清TNF-α、IL-10水平顯著高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生大黃治療組和聯(lián)合治療組可以降低SAP大鼠血清TNF-α水平，并減輕胰腺濕/干質(zhì)量比，其胰腺炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、壞死等病理組織學(xué)改變均明顯減輕，且在胰腺濕/干質(zhì)量比和胰腺組織病理積分上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中兩個(gè)治療組的SAP大鼠血清TNF-α水平與模型組有降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量偏少有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。生大黃組和聯(lián)合組均降低SAP大鼠血清IL-10水平，其中聯(lián)合治療組SAP大鼠血清IL-10水平明顯高于生大黃組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明生大黃和培菲康可以減輕SAP大鼠胰腺的組織病理學(xué)改變并降低血清炎性介質(zhì)TNF-α、IL-10的水平，阻止全身病情加重，其中聯(lián)合治療組中的培菲康可以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性的IL-10，提升血清IL-10的水平，對(duì)AP的早期治療及預(yù)防中均起到了關(guān)鍵的作用。

生大黃聯(lián)合微生態(tài)制劑治療SAP的作用結(jié)果可能為保護(hù)和重建腸屏障功能，促進(jìn)腸道功能早期恢復(fù)，重建促抗炎細(xì)胞因子的平衡，進(jìn)而減輕SAP的炎癥反應(yīng)，將有利于降低SAP死亡率。

［1］Rongione AJ，Kusske AM，Kwan K，et al.Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rats［J］.Gastroenterology，1997，112：960-967.

［2］王剛，孫備.白介素10在急性胰腺炎中的應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.世界華人消化雜志，2005，13（1）：69-71。

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［4］陳磊，鄒曉平，田覓，等.腸內(nèi)免疫微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)對(duì)急性壞死性胰腺炎全身炎癥反應(yīng)影響的研究［J］.中華胰腺病雜志，2008，8（2）115-118.

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