劉曉庚 高 梅 陳梅梅 曹祟江 孔令艷 吳 珂 李鳳月 彭冬梅

多酶法提取高溫菜籽粕中蛋白質(zhì)的工藝及其優(yōu)化

劉曉庚 高 梅 陳梅梅 曹祟江 孔令艷 吳 珂 李鳳月 彭冬梅

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210046)

通過比較菜籽蛋白的各種提取方法，設(shè)計(jì)了以高溫壓榨菜籽粕為原料，采用多酶解法與堿提酸沉法相結(jié)合的新工藝提取菜籽粕蛋白質(zhì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，著重研究酶解過程，并用L9(34)正交優(yōu)化試驗(yàn)得到了多酶酶解最佳工藝條件為:pH為9．0，溫度為50℃，料液比為1∶10，多酶以α－淀粉酶+纖維素酶為宜，且加入量為α－淀粉酶90 U/g粕、纖維素酶45 U/g粕;在此最優(yōu)條件下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得蛋白質(zhì)提取率為98．96%，菜籽蛋白產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量為99．04%，產(chǎn)品為無特殊氣味淺黃色的細(xì)晶粒和粉末固體。

高溫菜籽餅粕 蛋白質(zhì) 提取 酶解法 紫外分光光度法

油菜(rape)是中國最重要的油料作物，20世紀(jì)80年代以來，我國油菜種植面積和油菜籽總產(chǎn)量均居世界首位，占世界油菜種植面積和總產(chǎn)量近30%［1］。油菜籽除含大量油脂外，還含25%～27%蛋白質(zhì)，制油后菜籽粕含35%～45%蛋白質(zhì)［2］。目前，菜籽濃縮蛋白的制備工藝主要是從大豆?jié)饪s蛋白的制備工藝演變而來。但是菜籽蛋白沒能像大豆蛋白那樣應(yīng)用廣泛，原因主要有兩個(gè):一是菜籽中含有硫代葡萄糖苷、植酸、單寧、芥子堿、皂素等毒物和抗?fàn)I養(yǎng)成分，限制了它在飼料及食品工業(yè)中的應(yīng)用，以致造成蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi);二是對菜籽蛋白的研究力度遠(yuǎn)不及對大豆蛋白的研究，直到20世紀(jì)90年代，國內(nèi)外學(xué)者才逐漸花精力到菜籽蛋白的研究當(dāng)中。

從菜籽粕中提取蛋白質(zhì)的主要方法有水相法［3－4］、有機(jī)溶劑法［5］，另一些是在水相萃取基礎(chǔ)上的輔助提取法，如超聲微波輔提法［6］、水相酶解法［7］、雙液相萃取法［8－9］、堿提酸沉與超濾相結(jié)合方法［10－12］、Burco法［13］等，這些輔助法均提高了蛋白質(zhì)提取率。經(jīng)分析比較后設(shè)計(jì)了提取菜籽粕蛋白質(zhì)的新方案。

1 材料與方法

1．1 主要材料和儀器

高溫菜籽粕:南京隆盛植物油脂有限公司;α－

BS 224S電子天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;PHS－3C型pH計(jì):上海精密科學(xué)儀器有公司;HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;LD5－10低速離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠;UV－8000A紫外/可見分光光度計(jì):上海元析儀器有限公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 菜籽粕的預(yù)處理方法

將菜籽粕敲碎成小塊，粉碎過80目標(biāo)準(zhǔn)篩，裝入濾紙包后置于索氏脂肪提取器中，用石油醚浸提脫油，直至索氏抽提桶中的液體澄清。取出菜籽粕粉，讓石油醚蒸發(fā)晾干，裝于密封袋備用。

1．2．2 菜籽粕蛋白質(zhì)的提取方法

1．2．2．1 酶解方法

稱取10 g(準(zhǔn)確至0．01 g，下同)預(yù)處理過的菜籽粕粉，按料液比1∶10加入磷酸緩沖液和蒸餾水共100 mL，水浴鍋50℃，加入一定量的酶，50～100 r/min攪拌，反應(yīng)3 h。反應(yīng)完成后，3 000～4 000 r/min離心20 min。上層清液(可稀釋后)用紫外吸收光度法測定菜籽蛋白溶液吸光度(ΔA280)，計(jì)算蛋白質(zhì)的提取率［14］。

蛋白質(zhì)提取率=(上清液中菜籽蛋白質(zhì)的量/菜籽粕粉中蛋白質(zhì)的量)×100%

1．2．2．2 堿提酸沉蛋白質(zhì)制備方法

取1．2．2．1中離心后的下層沉淀加120 mL水，0．5 mol/L NaOH調(diào)pH至10．0，保持55℃攪拌2 h，3 000 r/min離心20～30 min，合并兩次上清液，滴加0．5 mol/L HCl調(diào)pH至4．0，有沉淀析出，靜置15～20 min后，4 000 r/min離心20～30 min，下層沉淀再加5倍體積70%乙醇，室溫振蕩下浸提30～40 min，3 000 r/min離心15～20 min，分別用2倍體積水洗滌2～3次，3 000～4 000 r/min離心15～20 min，下層沉淀冷凍干燥即得菜籽蛋白質(zhì)，稱重，計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

蛋白質(zhì)得率=(菜籽蛋白質(zhì)制品的質(zhì)量/菜籽粕粉的質(zhì)量)×100%

1．2．3 蛋白質(zhì)含量的測定方法

蛋白質(zhì)含量的測定采用紫外吸收分光光度法［14］，以試劑空白做對照。經(jīng)試驗(yàn)測得蛋白質(zhì)濃度為0～1．00 mg/mL內(nèi)，其線性方程為ΔA280=0．652c－0．005 7，且R2=0．999 8。

1．2．4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用Microsoft Excel 2003軟件處理試驗(yàn)相關(guān)的數(shù)據(jù)，用直觀分析法和方差分析法來對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 酶的選擇

預(yù)處理好的菜籽粕中除含蛋白質(zhì)外，還含一定量的淀粉、纖維素和果膠等，要打破菜籽細(xì)胞壁提取蛋白質(zhì)就要有破解細(xì)胞壁的方法，而目前最有效的是酶解破壁法。由于菜籽細(xì)胞壁主要是由淀粉、纖維素和果膠等組成，因此，試驗(yàn)選用的酶有α－淀粉酶、纖維素酶、果膠酶。為準(zhǔn)確快捷地得到酶解法提取菜籽粕蛋白質(zhì)的條件，先將這3種酶的適用條件列出(表1)。

表1 酶的適用條件

2．2 α－淀粉酶用量的確定

分別選擇0、60、90、120、150、210、300 U/g粕用量的α－淀粉酶按1．2中的試驗(yàn)方法測定其對蛋白質(zhì)提取率的影響(見圖1)。由圖1可知，隨著α－淀粉酶的增加菜籽蛋白溶液中溶出的蛋白質(zhì)越多，且0～0．04 g有較好的線性關(guān)系，考慮到酶的用量帶來的試驗(yàn)成本問題，所以，α－淀粉酶的用量確定為0．03 g即 α －淀粉酶的酶活力為90 U/g粕為宜。

圖1 α－淀粉酶對菜籽粕蛋白質(zhì)提取的影響

2．3 α－淀粉酶與纖維素酶活力比的確定

在α－淀粉酶用量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上按α－淀粉酶與纖維素酶的酶活比分別為1∶2、1∶1、3∶2、4∶3、2∶1、5∶2添加纖維素酶，其結(jié)果如圖2。由圖2可知，當(dāng)α－淀粉酶與纖維素酶的酶活比為2∶1時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率為最大，達(dá)92．54%，故接下來的試驗(yàn)所用α－淀粉酶與纖維素酶的酶活比選定為2∶1。

圖2 α－淀粉酶與纖維素酶活力比對菜籽粕蛋白質(zhì)提取的影響

2．4 果膠酶用量的影響

在確定了α－淀粉酶與纖維素酶的酶活比為2∶1的基礎(chǔ)上，繼續(xù)分別按0、5、10、20、30、50、100 U/g粕的量添加果膠酶進(jìn)行試驗(yàn)，以探明多酶共同作用下對菜籽粕蛋白質(zhì)提取的影響，所得試驗(yàn)結(jié)果見圖3。從圖3可知，添加果膠酶對菜籽中蛋白質(zhì)的提取幾乎沒有貢獻(xiàn)，蛋白質(zhì)提取率仍穩(wěn)定在92．67%～92．75%，較不加果膠酶的92．54%僅提高了0．14%～0．23%。

圖3 果膠酶用量對菜籽粕蛋白質(zhì)提取的影響

2．5 酶法(α－淀粉酶、纖維素酶)提取菜籽蛋白質(zhì)條件的優(yōu)化

固定反應(yīng)時(shí)間3 h，并以反應(yīng)溫度、酶的用量(α－淀粉酶與纖維素酶的酶活比為2∶1)、pH和料液比4個(gè)因素為進(jìn)一步優(yōu)化考察的對象，依據(jù)優(yōu)化理論設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)來優(yōu)化確定其最佳工藝條件［15－16］。該正交試驗(yàn)因素表見表2，其試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)的結(jié)果及分析(n=3)

由表3可以看出，采用方差分析法分析各因素對菜籽粕蛋白質(zhì)提取影響順序?yàn)?pH＞料液比＞酶的用量＞反應(yīng)溫度?？梢姺磻?yīng)pH對蛋白質(zhì)提取的影響最大，屬極顯著的影響因素，而反應(yīng)溫度的影響最小。正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的提取菜籽粕蛋白的最優(yōu)條件為:反應(yīng)溫度為50℃、酶用量為135 U/g粕(α －淀粉酶90 U/g粕、纖維素酶45 U/g粕)、pH為9．0、料液比為1∶10。

2．6 最佳試驗(yàn)條件的確定及試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)所得的酶法提取菜籽粕蛋白的最優(yōu)方案，依試驗(yàn)設(shè)計(jì)的理論［15］推算出酶法提取菜籽蛋白的理論最優(yōu)提取率為:

在此最佳條件下進(jìn)行的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明蛋白質(zhì)的提取率為98．96%，與理論推算的107．12%相差7．62%。產(chǎn)生此差別的原因可能來自3個(gè)方面，首先是試驗(yàn)操作過程中的誤差，如過濾時(shí)的粘壁等;其次是正交優(yōu)化試驗(yàn)和該推算方法本身模式與試驗(yàn)的實(shí)際存在不吻合造成誤差;還有就是紫外吸收法本身存在測定誤差以及紫外分光光度計(jì)受測定環(huán)境條件等也可造成誤差。

所得蛋白質(zhì)提取液經(jīng)冷凍干燥等操作制得無特殊氣味、淺黃色的微細(xì)晶粒和粉末混合的固體狀產(chǎn)品，經(jīng)測定該產(chǎn)品的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99．04%，菜籽粕中蛋白質(zhì)得率為28．37%，但該蛋白質(zhì)產(chǎn)品的性能和應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

3．1 用單一的酶法提取菜籽粕蛋白質(zhì)遠(yuǎn)沒有多酶法效果顯著，用α－淀粉酶時(shí)蛋白質(zhì)的提取率僅為72．52%而用α－淀粉酶+纖維素的多酶法提取菜籽粕蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)98．96%。但果膠酶對高溫菜籽粕中蛋白質(zhì)提取幾乎沒有貢獻(xiàn)作用。

3．2 通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的多酶法提取高溫菜籽粕中蛋白質(zhì)的最佳工藝條件是:pH 9．0，溫度為50℃，料液比為1∶10，多酶以α－淀粉酶+纖維素酶為宜，且加入量為α－淀粉酶90 U/g粕、纖維素酶45 U/g粕;在此最優(yōu)條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)所得蛋白質(zhì)提取率為98．96%，菜籽蛋白產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量為99．04%，產(chǎn)品為無特殊氣味淺黃色的細(xì)晶粒和粉末混合固體。

3．3 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的多酶法提取蛋白質(zhì)方案是適合高溫菜籽粕中蛋白質(zhì)提取的，但對工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用尚須進(jìn)一步進(jìn)行放大試驗(yàn)等研究工作。

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The Technology and Optimization for Multi－Enzymatic Extraction Protein from High－Temperature Rapeseed Meal

Liu Xiaogeng Gao Mei Chen Meimei Cao Chongjiang Kong Lingyan Wu Ke Li Fengyue Pen Dongmei
(School of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance＆Economics，Nanjing 210046)

By comparing a variety of rapeseed protein extraction method，we designed high－temperature pressed rapeseed as raw material and applied the new technology which combines multi－enzyme with alkaline extraction and acid precipitation to extract rapeseed meal protein．Based on the single －factor test，the study focused on the enzymatic process，and made L9(34)orthogonal experiment to get the optimum conditions of multi－enzyme digestion:pH 9．0，temperature 50℃，solid－liquid ratio of 1∶10．A multi－enzyme withα－amylase+cellulase was appropriate，and the added amount wasα－amylase 90 U/g，and cellulase 45 U/g．Under the optimal conditions，the protein extraction ratio derived from verification experiment was 98．96%，and the protein content of rapeseed protein products was 99．04%．The products were fine grain and light yellow powder solid with no special odor．

high－temperature rapeseed meal，protein，extraction，enzymatic hydrolysis，UV spectrophotometry

TQ644．16;TS201．1;TS224．4

A

1003－0174(2012)08－0069－04

江蘇省高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項(xiàng)目(ZL10001)

2011－10－27

劉曉庚，男，1962年出生，教授，碩士生導(dǎo)師，食品科學(xué)淀粉酶:北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;纖維素酶、果膠酶:上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品牛血清蛋白:Sigma公司;KH2PO4(分析純)等化學(xué)試劑:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。pH 5．0、7．0的磷酸鹽緩沖液和pH 9．0的硼酸鹽緩沖液:自配;蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取經(jīng)微量凱氏定氮法校正的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成濃度為1．00 mg/mL的溶液。