徐立春 陳海燕 文 潔 陶亞玲

揚州大學醫(yī)學院腫瘤防治研究中心，江蘇揚州 225001

莪術(shù)醇對人胃癌細胞凋亡、MMP2、NO影響的初步探討

徐立春 陳海燕 文 潔 陶亞玲

揚州大學醫(yī)學院腫瘤防治研究中心，江蘇揚州 225001

目的 初步探討莪術(shù)醇（Curcumol）對人胃腺癌細胞（SGC-7901細胞）凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2）、一氧化氮（NO）的影響。 方法 將莪術(shù)醇溶于無水乙醇中，初始濃度為9 mg/mL，設實驗1、2、3、4、5組，莪術(shù)醇的濃度分別是7.5、15、30、60、120 μg/mL，并以含 1%無水乙醇的培養(yǎng)液為對照組。 采用臺盼藍（Trypan blue）、噻唑藍（MTT）法檢測SGC-7901細胞的活性及莪術(shù)醇對SGC-7901細胞抑制增殖的影響；用流式細胞儀 （FACSCalibur）檢測莪術(shù)醇對SGC-7901細胞的凋亡率；用蛋白質(zhì)印跡法檢測莪術(shù)醇作用于SGC-7901細胞后，其MMP2的表達情況；NO試劑盒檢測莪術(shù)醇作用SGC-7901細胞后的細胞培養(yǎng)液上清的NO含量。 結(jié)果30μg/mL的莪術(shù)醇在藥物濃度與抑制腫瘤生長方面效果較佳，與對照組比較，其抑制腫瘤細胞增殖差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；莪術(shù)醇實驗組能促進細胞凋亡，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；莪術(shù)醇實驗組作用細胞后，其MMP2蛋白表達明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；實驗研究表明，隨著莪術(shù)醇實驗組濃度的增加，其細胞培養(yǎng)液上清中的NO含量逐漸降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 30μg/mL的莪術(shù)醇濃度是最佳藥效組，它能顯著抑制SGC-7901細胞的增殖，明顯促進腫瘤的細胞凋亡，顯著抑制MMP2的表達，降低細胞培養(yǎng)液上清中的NO含量，從而發(fā)揮系列抗腫瘤作用。本研究從細胞分子水平探討莪術(shù)醇治療胃癌可能存在的部分機制，為臨床應用莪術(shù)醇及其衍生物或結(jié)構(gòu)類似物治療胃癌提供理論與試驗依據(jù)。

莪術(shù)醇；SGC-7901；凋亡；基質(zhì)金屬蛋白酶；一氧化氮

胃癌在我國是最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)是其最有效的治療方法，對于術(shù)后復發(fā)失去再次手術(shù)機會的及晚期胃癌患者，化療仍是最有效的手段之一，但其療效不盡人意，因為在消滅腫瘤細胞的同時，受其毒副作用影響而表現(xiàn)出較差的預后。因而尋求一種新的治療方案迫在眉睫。腫瘤的靶向治療基于分子水平，通過抑制相關(guān)蛋白或基因在信號轉(zhuǎn)導通路、血管生成等途徑發(fā)揮較強的抗腫瘤作用，且細胞毒性作用明顯減少，故成為腫瘤治療的新希望。

近年來，中藥及其有效成分抗腫瘤作用的研究取得很大進展。研究顯示，天然藥物及有效成分可以通過誘導細胞凋亡、細胞分化、抑制血管生成、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等發(fā)揮抗腫瘤作用。同時中藥具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應、毒副作用低、提高機體免疫力、不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點。莪術(shù)醇（Curcumol）又名姜黃環(huán)奧醇，為具有半縮酮的氫化奧類化合物，為莪術(shù)的提取物——莪術(shù)揮發(fā)油中抗腫瘤活性成分。目前研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)提取物莪術(shù)醇能殺傷腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞凋亡，有抑制血管生成的作用，且不良反應少，有學者認為抑制腫瘤生長與抑制環(huán)氧化酶2mRNA和血管內(nèi)皮生長因子mRNA的表達有關(guān)[1-4]。

本研究以人胃腺癌（SGC-7901）細胞為研究對象，采用現(xiàn)代高新技術(shù)從細胞分子水平探討莪術(shù)醇抑制胃癌細胞生長可能存在的部分機制，為臨床應用莪術(shù)醇及其衍生物或結(jié)構(gòu)類似物治療胃癌提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

①莪術(shù)醇 （純度95%）：揚州大學中西醫(yī)結(jié)合研究所提供。②RPMI-1640培養(yǎng)基：美國GIBCO公司；③Annexin VFITC試劑盒：上海晶美生物工程有限公司；④Braford檢測蛋白含量試劑盒、Mouse Anti-actin、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP：武漢博士德生物工程有限公司；⑤Rabbit Anti-MMP2：美國eBioscience公司；⑥NO試劑盒：南京建成生物公司；⑦MTT、DMSO：上海生工生物工程有限公司；⑧細胞株：人胃腺癌SGC-7901細胞株由上海細胞生物所提供。

1.2 方法

1.2.1 將莪術(shù)醇溶于無水乙醇溶液，其工作濃度中乙醇的最終濃度為1%，設實驗組和對照組，實驗組莪術(shù)醇的濃度為7.5、15、30、60、120 μg/mL。SGC-7901 細胞復蘇后加入 RPMI1640培養(yǎng)液（pH=7.2，10%小牛血清，青霉素及鏈霉素各100 U/mL）后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 采用MTT法檢測不同濃度組的莪術(shù)醇對人胃腺癌SGC-7901細胞細胞增殖的影響。將對數(shù)生長期的SGC-7901細胞計數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約5 000個細胞，設6個復孔，200μL/孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，更換含莪術(shù)醇的培養(yǎng)液，藥物濃度及分組按實驗設計進行。培養(yǎng)48 h后，于每孔加入20μL四甲基偶氮唑藍（MTT）溶液（5 mg/mL），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，棄上清，每孔分別加入150μL二甲基亞砜（DMSO），輕輕振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。酶標儀在波長490 nm下測定各孔的OD值，記錄結(jié)果。

1.2.3 流式細胞儀（FACSCalibur）檢測莪術(shù)醇對SGC-7901細胞凋亡率的影響。SGC-7901細胞培養(yǎng)、莪術(shù)醇的藥物濃度及分組同前。然后將乙醇固定的細胞離心洗滌后去上清，搖勻，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，加入Binding Buffer 500μL懸浮細胞，加入AnnexinV-FITC 5μL混勻后，加入碘化丙錠（Propidium Iodide，PI）5μL，震蕩混勻，室溫，避光，反應 5～15min，用200目尼龍網(wǎng)濾過后，上機檢測，計數(shù)10 000個細胞進行細胞凋亡率分析。用流式細胞儀檢測，其激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm。此實驗重復3次。

1.2.4 用Western Blot法檢測莪術(shù)醇對SGC-7901細胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2）表達的影響。SGC-7901細胞培養(yǎng)、莪術(shù)醇的藥物濃度及分組同前。實驗組、對照組培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)。然后從SGC-7901細胞中提取總蛋白，用Bradford法檢測蛋白含量，接著進行制膠、加樣、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫印跡操作，所得Western條帶應用圖像凝膠成像系統(tǒng)存入計算機，用Quantity One灰度分析軟件進行光密度計算，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值作為相應目的蛋白的表達量指標，每個樣本重復3次[5]。

1.2.5 用一氧化氮（NO）試劑盒檢測莪術(shù)醇對SGC-7901細胞培養(yǎng)液中NO含量的影響。SGC-7901細胞培養(yǎng)、莪術(shù)醇的藥物濃度及分組同前。培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)液，再1 000 r/min離心5min，收集上清液。用NO試劑盒進行實驗，在550 nm波長下測各管吸光度值[6]。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞生長抑制的影響

7.5 ～120 μg/mL莪術(shù)醇處理 SGC-7901腫瘤細胞 48 h后，莪術(shù)醇抑制細胞生長作用隨其濃度的增加而逐漸增強，實驗組的抑制率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義 （P<0.05）。 見表 1。

表1 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞生長抑制效應結(jié)果比較（，%）

表1 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞生長抑制效應結(jié)果比較（，%）

注：與對照組比較，＊P＜0.05

組別 抑制率對照組（1%無水乙醇組）實驗組7.5μg/mL莪術(shù)醇組15μg/mL莪術(shù)醇組30μg/mL莪術(shù)醇組60μg/mL莪術(shù)醇組120μg/mL莪術(shù)醇組0.19±0.12 4.48±0.35＊8.49±0.49＊30.21±0.71＊45.20±0.79＊57.51±1.30＊

2.2 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞凋亡的影響

隨著莪術(shù)醇對SGC-7901腫瘤細胞的濃度增加，SGC-7901細胞發(fā)生凋亡的細胞比例逐漸增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞凋亡率的影響效應結(jié)果（，%）

表2 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞凋亡率的影響效應結(jié)果（，%）

注：與對照組比較，＊P＜0.05

組別 凋亡率對照組（1%無水乙醇組）實驗組7.5μg/mL莪術(shù)醇組15μg/mL莪術(shù)醇組30μg/mL莪術(shù)醇組60μg/mL莪術(shù)醇組120μg/mL莪術(shù)醇組5.10±0.21 6.62±0.13＊12.25±0.34＊28.80±0.16＊40.75±0.44＊48.84±0.35＊

2.3 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞MMP2表達的影響

MMP2能降解細胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜成分，使基底膜喪失連續(xù)性，從而破壞局部組織結(jié)構(gòu)達到侵襲和轉(zhuǎn)移。不同濃度的莪術(shù)醇作用SGC-7901細胞48 h后，提取細胞總蛋白，采用Western Blot檢測MMP2蛋白的變化。與對照組比較，不同濃度的莪術(shù)醇作用細胞后，隨著藥物濃度的增加，與對照組比較MMP2蛋白表達均有不同水平的下調(diào)，莪術(shù)醇實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.4 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞培養(yǎng)液中NO含量的影響

隨著莪術(shù)醇作用濃度的增加，SGC-7901細胞的培養(yǎng)液的上清中的NO含量逐漸下降，除7.5μg/mL莪術(shù)醇組外，其他莪術(shù)醇組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞上清液中的NO含量的影響（，μmol/L）

表3 莪術(shù)醇對SGC-7901細胞上清液中的NO含量的影響（，μmol/L）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 NO含量對照組（1%無水乙醇）實驗組7.5μg/mL莪術(shù)醇組15μg/mL莪術(shù)醇組30μg/mL莪術(shù)醇組60μg/mL莪術(shù)醇組120μg/mL莪術(shù)醇組158.79±7.02 150.06±4.07 137.65±3.55*123.94±2.44*102.95±3.40*78.32±3.88*

3 討論

隨著醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，中藥及其有效成分抗腫瘤作用的研究取得很大的進展，有研究報道天然藥物及其有效成分可以通過誘導細胞凋亡、藥物毒性作用、調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導、誘導細胞分化、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、抑制端粒酶活性等方式發(fā)揮抗腫瘤作用。莪術(shù)醇是中藥莪術(shù)中提取的重要成分，目前研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇作為一種有效的抗腫瘤藥物，通過直接殺傷腫瘤細胞、增強腫瘤的免疫原性、增強機體的免疫力、抑制核酸代謝、抑制血管生成、誘導細胞凋亡、影響細胞分化等機制發(fā)揮作用[7-9]。

本實驗研究表明，莪術(shù)醇抑制胃腫瘤細胞生長率分別為：7.5 μg/mL 的莪術(shù)醇組生長抑制率是（4.48±0.35）%，15 μg/mL生長抑制率為（8.49±0.49）%，30μg/mL 生長抑制率為（30.21±0.71）%，60 μg/mL 生長抑制率為 （45.20±0.79）%，120 μg/mL生長抑制率為（57.5±1.30）%。從藥效比分析30μg/mL莪術(shù)醇組是最佳抑制腫瘤細胞增殖的濃度。

細胞凋亡是由死亡信號誘發(fā)的受調(diào)節(jié)的細胞死亡過程，是生理性死亡的普遍形式。凋亡過程中DNA發(fā)生片段化，細胞皺縮分解成凋亡小體，被鄰近細胞或巨噬細胞吞噬，不發(fā)生炎癥。與細胞壞死的區(qū)別是，壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程，其表現(xiàn)為細胞長大，胞膜破裂，細胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應。本實驗采用流式細胞技術(shù)來進行凋亡分析，其原理是在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合，碘化丙啶（PI）不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，能透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V和PI匹配使用，可將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。本實驗用流式細胞技術(shù)來檢測莪術(shù)醇對SGC-7901細胞的誘導凋亡作用，結(jié)果是：7.5μg/mL的莪術(shù)醇組其細胞凋亡率是 （6.62±0.13）%，15μg/mL時其凋亡率為 （12.25±0.34）%，30 μg/mL 時其凋亡率為 （28.80±0.16）%，60 μg/mL 時凋亡率為（40.75±0.44）%，120 μg/mL 凋亡率為（48.84±0.35）%，從這組數(shù)據(jù)中可以觀察到SGC-7901細胞隨著莪術(shù)醇藥物濃度的增加，其細胞的凋亡比例顯著增加，呈藥物劑量依賴性。從藥物濃度與凋亡作用效果分析，30μg/mL莪術(shù)醇組是最佳濃度組[10-12]。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是需要腫瘤細胞和腫瘤基質(zhì)成分共同參與的主動過程，包括腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，細胞外基質(zhì)的降解，腫瘤細胞穿透并進入鄰近組織[13]。腫瘤細胞可產(chǎn)生多種蛋白水解酶降解細胞外基質(zhì)，因基質(zhì)金屬蛋白酶幾乎能降解細胞外所有成分，故被認為是該過程中主要的蛋白水解酶?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能促進腫瘤細胞突破細胞外基質(zhì)的組織學屏障，向鄰近組織侵襲和遠處轉(zhuǎn)移，幾乎能降解細胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分和胞外蛋白，故被認為是侵襲過程中的主要的蛋白水解酶，其家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，一般由5個功能不同的結(jié)構(gòu)域組成。MMPs成員在上述結(jié)構(gòu)的基礎上各有特點。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌中的MMP2的表達，可能是促使腫瘤發(fā)生、生長和浸潤轉(zhuǎn)移的重要因素，故可作為判斷腫瘤惡性程度的重要指標。本實驗通過Western Blot檢測莪術(shù)醇作用于SGC-7901細胞后的MMP2的表達水平，觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的莪術(shù)醇作用于SGC-7901細胞后，隨著濃度的增大，MMP2蛋白表達水平明顯降低，呈劑量依賴性，筆者認為其機制可能是莪術(shù)醇通過下調(diào)SGC-7901細胞中的MMP2蛋白表達水平，保護了基底膜的完整性，從而降低SGC-7901細胞降解細胞外基質(zhì)的能力[14-15]。

NO在機體內(nèi)以L-精氨酸為底物，在一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化作用下生成。腫瘤來源的NO在腫瘤細胞的增殖、生存、轉(zhuǎn)移和侵襲方面表現(xiàn)為介導作用。NO對腫瘤的作用，有學者認為是促進，也有學者認為是抑制，這種矛盾的存在成了NO研究的熱點。在腫瘤早期，NO可通過介導DNA損傷來參與腫瘤的形成過程，它通過誘導血管生成、刺激腫瘤細胞的侵襲性和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來促進腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。本實驗采用一氧化氮試劑盒測定培養(yǎng)液上清中的NO含量，其原理是NO化學性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)化為NO2和NO3，而NO2又進一步轉(zhuǎn)化為NO3-，NO2-的進一步轉(zhuǎn)化，是利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原為NO2-，通過顯色深淺測定其濃度的高低。本實驗采用一氧化氮試劑盒來檢測莪術(shù)醇作用于SGC-7901細胞后，其細胞培養(yǎng)液上清中NO含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇抑制了SGC-7901細胞的的NO的產(chǎn)生，與顧建華等證實的誘導型一氧化氮合酶選擇性抑制劑氨基胍（AG）抑制鼠胃癌MFC細胞NO產(chǎn)生發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長和增殖作用的結(jié)論相同。所以本實驗在體外培養(yǎng)的單一環(huán)境中，莪術(shù)醇與SGC-7901胃癌細胞共同孵育的前提下，莪術(shù)醇抑制胃癌細胞生長和增殖的同時對NO也有抑制作用。隨著莪術(shù)醇藥物濃度組的增加，NO含量降低，從15μg/mL組到120μg/mL組的組間比較，差異有統(tǒng)計學意義，研究結(jié)果表明莪術(shù)醇通過量-效依賴性關(guān)系阻斷NO產(chǎn)生，從而拮抗NO促瘤作用發(fā)揮抗腫瘤效應[16-19]。

通過以上實驗研究顯示莪術(shù)醇抑制了SGC-7901細胞中的MMP2的表達，同時降低了SGC-7901細胞的培養(yǎng)液上清中的NO含量，筆者認為：①可能是莪術(shù)醇抑制了MMP2破壞基底膜的Ⅳ型膠原，保護了基底膜的完整性，從而抑制了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；②莪術(shù)醇作用于SGC-7901細胞后通過下調(diào)NO的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)MMP2和其抑制劑TIMP2、TIMP3之間的平衡，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；③莪術(shù)醇作用于SGC-7901細胞后通過下調(diào)NO的產(chǎn)生，并以劑量依賴方式來拮抗NO促瘤作用，從而發(fā)揮抗腫瘤效應。有關(guān)莪術(shù)醇抗腫瘤的作用機制的深入研究正在探索之中。

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Prelim inary discussion on effect of curcumol in apoptosis,MMP2 and NO in SGC-7901 cells

XU Lichun CHEN Haiyan WEN Jie TAO Yaling
Cancer Prevention Research Center,Medical College of Yangzhou University,Jiangsu Province,Yangzhou 225001,China

Objective To discuss the effects of Curcumol on the apoptosis,MMP2 and NO of human gastric cancer cells(SGC-7901 cells).MethodsCurcumolwas dissolved in dehydrate alcohol and the initial concentration of Curcumolwas 9 mg/mL.Group 1,group 2,group 3,group 4 and group 5 were set up as experimental groups.The Curcumol concentrations were set as follows:7.5,15,30,60,120μg/mL,control group contained 1%dehydrate alcohol(dissolvent compare).The Trypan blueand method was used to analyze the cytoactive of SGC-7901;MTT assay was performed to study the inhibitory rate of SGC-7901 cells proliferation;the metastasis of SGC-7901 was described through the scratches experiment;the apoptosis rate were detected by FACSCalibur and the expression of Matrixmetalloproteinase 2 (MMP2)were detected by Western Blot.The content of NO in cell culturemedium was detected by NO kit.ResultsCurcumol had a good effect on drug concentration and restrain the tumor growth in 30μg/mL,and compared with controls,it had significant difference in restrain the proliferation of tumor cell(P<0.05);Curcumol could promote the apoptosis,it showed significant difference when compared with controls (P<0.05);Curcumol could make the expression of MMP2 protein descend to varying degrees,it had significant difference when compared with controls(P<0.05);this research showed with the increasing of the concentration of curcumol,the content of the NO in the supernate gradually reduced,it had significant difference when compared with controls(P<0.05).ConclusionCurcumol in 30μg/mL is the best efficacy group,it can significantly inhibit the proliferation of SGC-7901 cell,significantly promote the tumor cell apoptosis,significantly inhibit the expression of MMP2,reduce the content of NO in supernate,and express the series antitumor function.This study discusses the possible mechanism of curcumol cure the stomach cancer from cell and molecular level;provide the basis in theory and experiment for clinical application that Curcumol and its derivatives or structure analogues treat stomach cancer.

Curcumol;SGC-7901;Apoptosis;MMP2;NO

R000

A

1673-7210（2012）12（a）-0018-04

江蘇省醫(yī)學衛(wèi)生重點基金資助項目（編號：K200511）。

徐立春，研究員，教授，主要從事腫瘤防治基礎與臨床方面的研究。

2012-07-02 本文編輯：馮 婕）