范建文 張姝江 董偉強 李 波 陳 藝 李立華

1.廣州市番禺區(qū)大石街社區(qū)衛(wèi)生服務中心，廣東廣州 511430；2.廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510000；3.暨南大學材料科學與工程系 人工器官與材料教育部工程中心，廣東廣州 510000

動態(tài)力學刺激對三維培養(yǎng)軟骨細胞作用的初步研究

范建文1張姝江2▲董偉強2李 波3陳 藝2李立華3

1.廣州市番禺區(qū)大石街社區(qū)衛(wèi)生服務中心，廣東廣州 511430；2.廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510000；3.暨南大學材料科學與工程系 人工器官與材料教育部工程中心，廣東廣州 510000

目的探討在三維多孔支架環(huán)境里動態(tài)循環(huán)壓力刺激對軟骨細胞的作用。 方法 原代培養(yǎng)兔軟骨細胞，傳代擴增后接種于 1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 聚乳酸多孔（polylactic acid，PLA）支架，培養(yǎng) 5 d后，施加 0.5、1、2 N 的正弦動態(tài)循環(huán)壓力，頻率0.017 Hz，加壓8 h，以無壓力組（0 N）作為對照。標本做掃描電鏡及組織學切片染色，觀察細胞數(shù)量、形態(tài)及排列的變化。 結果 在三維PLA多孔支架上，掃描電鏡觀察到，動態(tài)壓力組細胞的增殖比無壓力組更多，排列也更加有序；動態(tài)壓力為2 N的時候，細胞增殖、形態(tài)比1、0.5 N及無壓力組更好，貼附細胞計數(shù)與1、0.5 N及無壓力組相比差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。 結論 動態(tài)循環(huán)壓力對于三維培養(yǎng)條件下的軟骨細胞有促進增殖和有序排列的作用，但何種強度的壓力更適合體外構建組織工程軟骨尚需進一步研究。

組織工程；軟骨細胞；動態(tài)壓力；三維支架

關節(jié)軟骨在損傷后缺乏自身修復能力，尋找合適的替代軟骨修復損傷是近年的研究熱點。體外構建組織工程軟骨是修復軟骨損傷的一種新手段[1]，并且隨著研究的深入，力學刺激，尤其是壓應力對軟骨細胞在三維支架中黏附生長及分泌細胞外基質(zhì)等的作用越來越受到重視。有研究表明，周期性壓力能促進軟骨細胞的增殖和基質(zhì)的分泌[2]。聚乳酸（polylactic acid，PLA）支架是軟骨研究中的常用支架材料，具有較好的力學強度，能傳導應力并為細胞提供三維生長環(huán)境。在本研究中，筆者著重觀察軟骨細胞在體外三維PLA多孔支架上受到循環(huán)壓應力時的增殖情況及形態(tài)改變。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基，Ⅱ型膠原酶，胰蛋白酶，新生小牛血清，磷酸緩沖液（PBS），多聚甲醛，2.5%戊二醛；1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm聚乳酸（polylactic acid，PLA）多孔支架（濟南岱罡生物工程有限公司），孔隙率85%；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），動態(tài)力學反應器（Bose公司，美國），Nikon倒置成像系統(tǒng)（Nikon公司，日本），Leica光學顯微鏡（Leica公司，德國），掃描電鏡（Quanta 200，F(xiàn)EI公司，美國）。

1.2 實驗方法

無菌條件下取1月齡新西蘭白兔膝關節(jié)軟骨，含雙抗的PBS反復清洗，剪碎成1mm×1mm大小組織塊，加入適量Ⅱ型膠原酶，37℃消化4 h；收集細胞，1 500 rpm離心5min，去上清，加入含20%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，吹打成混懸液，接種到25 cm的培養(yǎng)瓶，擴增傳代后，選擇二代軟骨細胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集后，以106個/支架接種到PLA多孔支架上。培養(yǎng)7 d后，將復合軟骨細胞的支架分為四組，每組兩個標本。無壓力組為不加壓力的靜態(tài)培養(yǎng)；其他三組置于動態(tài)力學反應器，分別施以0.5、1、2 N的動態(tài)循環(huán)壓力，10min一個正弦周期（頻率0.017 Hz），加壓8 h。軟骨細胞-PLA支架標本分別以2.5%戊二醛固定，送掃描電鏡觀察，多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色觀察。每組切片隨機選取5個視野，計數(shù)支架材料上的貼附細胞，取均值做統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 掃描電鏡

未施加動態(tài)壓力的軟骨細胞-PLA在電鏡下可見細胞呈扁平狀鋪展，胞體不規(guī)則收縮，可見細胞核隆起，細胞數(shù)量少；0.5 N、1 N及2 N動態(tài)壓力作用后的軟骨細胞在支架上呈拉絲狀伸出偽足，胞體形態(tài)較圓，其中以2 N動態(tài)壓力組此種形態(tài)細胞最多見（圖1）。

2.2 HE染色觀察

無壓力組的細胞在支架材料的空隙間及表面呈無序、散在貼附生長，細胞量少；0.5 N動態(tài)壓力組的軟骨細胞相較于1 N和2 N動態(tài)壓力組，細胞形態(tài)呈展開狀，分布較零散；2 N動態(tài)壓力組可見在支架孔隙表面，有均勻分布，呈條狀排列的軟骨細胞，數(shù)量較多，比1 N動態(tài)壓力組具有更密集的貼附生長以及更明顯的排列方向一致性（圖2）。四組貼附細胞計數(shù)情況見表1。

3 討論

各種原因導致的關節(jié)軟骨損傷是臨床的常見疾病，異體軟骨移植、假體代替以及自體骨膜移植等治療方法效果不甚理想。組織工程化軟骨為關節(jié)軟骨的修復提供了新的途徑，但是在體外簡單的培養(yǎng)，軟骨細胞與支架材料的復合物在膠原基質(zhì)以及力學強度等各方面都無法達到正常軟骨組織的要求。有研究發(fā)現(xiàn)，靜態(tài)壓力對軟骨組織有抑制作用[3-4]，而動態(tài)的壓力刺激可以使軟骨細胞分布更加均勻，改善細胞微結構，刺激細胞外基質(zhì)的分泌[5-6]。

表1 四組貼附細胞計數(shù)情況（，n=5）

表1 四組貼附細胞計數(shù)情況（，n=5）

注：與無壓力組比較，*P<0.05；與0.5 N動態(tài)壓力組比較，#P<0.05；與1 N動態(tài)壓力組比較，&P<0.05

組別 細胞計數(shù)（106/mL）無壓力組0.5 N動態(tài)壓力組1 N動態(tài)壓力組2 N動態(tài)壓力組1.6±1.67 1.4±1.14 5.2±2.59*13.2±8.98*#&

Martin等[7]研究認為，生理條件下不同組織的受力環(huán)境是不同的，對特定組織，力的施加方式、強度、頻率都尚需要詳細研究。周期性壓力可以促進軟骨細胞的增殖和分泌基質(zhì)，不同頻率的周期性壓力的作用效果不同。范衛(wèi)民等[8]對比三種不同頻率的周期性壓力發(fā)現(xiàn)，0.1 Hz與0.01 Hz周期壓力能更好地促進軟骨細胞增殖，并且分泌更多Ⅱ型膠原和糖胺多糖，而在達到1 Hz頻率時，軟骨細胞增殖及基質(zhì)分泌則低于無壓力刺激組。持續(xù)的周期性壓力也會抑制軟骨細胞的正常功能，有研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)施加24 h壓力可使軟骨細胞的Ⅱ型膠原表達下調(diào)并出現(xiàn)凋亡[9]。盛英俊等[10]發(fā)現(xiàn)，采用0～200 kPa、1 Hz的動態(tài)壓力，作用8 h能獲得促進軟骨細胞增殖，Ⅱ型膠原及糖胺多糖表達的最好效果。上述實驗的支架采用的是無紡網(wǎng)支架，對動態(tài)應力的反應與實際的體內(nèi)環(huán)境尚有差別。有研究者認為，在三維條件下，施加動態(tài)壓力，有助于軟骨細胞表型的分化和維持[11-13]。

在本實驗中，筆者采用立體的三維多孔PLA支架，模擬體內(nèi)軟骨細胞的生長環(huán)境，了解在此情況下，周期循環(huán)壓力對軟骨細胞的影響。根據(jù)之前的文獻數(shù)據(jù)，本研究選擇了有利于刺激軟骨細胞增殖及分泌基質(zhì)的頻率（0.017Hz）以及時長（8 h）。PLA三維多孔支架相對于無紡網(wǎng)有更加良好的力傳導性能，采用動態(tài)壓力并以正弦方式加壓時，筆者觀察到的確有促進細胞增殖和均勻分布的效果，細胞形態(tài)也隨壓力刺激而有所變化，沿應壓力作用施加的方向排列。對比無壓力組、0.5 N動態(tài)壓力組、1 N動態(tài)壓力組以及2 N動態(tài)壓力組，在同樣施力變化頻率及作用時間相同的條件下，細胞貼附生長數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），顯示以2 N動態(tài)壓力組效果最佳。這與之前在無紡網(wǎng)支架上觀察到的效果相似。對于此類有一定力學強度的三維多孔支架材料，軟骨細胞在其中生長的受力情況更接近體內(nèi)環(huán)境；在適宜的動態(tài)周期循環(huán)壓力作用下，其Ⅱ型膠原和糖胺多糖的合成分泌情況，有待于下一步的研究。

[1]陸寧，盧世壁，王繼芳，等.采用自體成熟關節(jié)軟骨細胞的軟骨組織工程修復[J].中華實驗外科雜志，2005，22（3）：293-296.

[2]范衛(wèi)民，蔡俊.周期性壓力對組織工程軟骨的影響及其作用機制[J].中華實驗外科雜志.2006，23（8）：977-9 79.

[3]Sharma G，Saxena RK，Mishra P.Differential effects of cyclic and static pressure on biochemical and morphological properties of chondrocytes from articular cartilage[J].Clin Biomech，2007，22（2）：248-255.

[4]郭維華，李松，徐蕓.不同靜壓力對大鼠髁突軟骨細胞生物學特性的影響[J].華西口腔醫(yī)學雜志，2007，25（6）：603-605.

[5]Waldman SD，SpiteriCG，CrynpasMD，etal.Long term intermittent compressive stimulations improves the composition and mechanical propertiesof tissue-engineered cartilage[J].Tissue Eng，2004，10（9-10）：1323-1331.

[6]Elder SH，Sanders SW，McCulley WR，et al.Chondrocyte response to cyclic hydrostatic pressure in alginate versus pellet culture[J].JOrthop Res，2006，24（4）：740-747.

[7]Martin I，Wendt D，Heberer M.The role of bioreactors in tissue engineering[J].Trends Biotechnol， 2004，22：80-86.

[8]范衛(wèi)民，張廣程，馬益民，等.不同頻率周期性壓力對組織工程軟骨的影響[J].中華實驗外科雜志，2007，24：677-678.

[9]Nakamura S，Arai Y，Takahashi KA，et al.Hydrostatic pressure induces apoptosis of chondrocytes cultured in alginate beads[J].JOrthop Res，2006，24：733-739.

[10]盛英俊，范衛(wèi)民，馬益民，等.不同持續(xù)時間的周期性壓力對構建組織工程軟骨的影響[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志，2009，11（6）：546-550.

[11]Candiani G，Raimondi MT，Aurora R，et al.Chondrocyte response to high regimens of cyclic hydrostatic pressure in 3-dimensional engineered constructs[J].Int JArtif Organs，2008，31（6）：490-499.

[12]余瑞新，杜遠立.骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨分化的研究進展[J].中國醫(yī)藥導刊，2012，14(1)：94,103.

[13]白雪東，胡蘊玉，侯黎升，等.復合bBMP骨軟骨生物修復材料的實驗研究[J].中國醫(yī)藥導刊，2010，12(11)：1957-1958.

Prelim inary study of effect of dynam ic com pressive stress on three-dimentional cultured chondrocytes

FAN Jianwen1ZHANG Shujiang2▲DONGWeiqiang2LIBo3CHEN Yi2LILihua3
1.Dashi Community Health Service Center of Panyu District in Guangzhou City,Guangdong Province,Guangzhou 511430,China;2.The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou 510000,China;3.Department of Material Science and Engineering,Ji'nan University Engineering Research Center of Artificial Organs and Materials of Ministry of Education,Guangdong Province,Guangzhou 510000,China

Objective To investigate the effect of dynamic compressive stress on 3-dimentional cultured chondrocytes.MethodsChondrocytes of New Zealand rabbitwere obtained and proliferated on polylactic acid(PLA)porous scaffold with a size of 1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm.The cell-scaffold compositeswere divided into 4 groups,and were exposed to 0,0.5,1 and 2 N dynamic cyclic compressive stress respectively for 8 hours(in a frequency of 0.017 Hz).Scanning electronicmicroscope was performed to examine the cellmorphology on the scaffold,and histological staining was used to observe the cell proliferation and arrangement on the scaffold after compressive stress stimulation.ResultsOn the 3-D PLA scaffold,cells proliferated and arranged betterwhen they were exposed to dynamic cyclic compressive stress,and 2 N group was better than 1,0.5 and 0 N groups(P＜0.05).The number of cells attached to scaffold in 2 N group was significantly different from that of 1,0.5 and 0 N groups(P＜0.05).ConclusionDynamic cyclic compressive stressmay be beneficial to chondrocytes proliferation and arrangementon 3-D scaffold,butwhat extend of strength will be the best condition needs further study.

Tissue engineering;Chondrocyte;Dynamic compressive stress;Three-dimensional scaffold

R318.17

A

1673-7210（2012）12（a）-0011-03

廣東省廣州市番禺區(qū)科技計劃項目（2010-Z-100-1）；廣州醫(yī)學院青年基金項目（2010A16）。

▲通訊作者

2012-08-03 本文編輯：程 銘）