唐 婕,陳 蓉,謝梅林

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部,江蘇蘇州,215006;2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥理系,江蘇蘇州,215123)

多種心血管疾病如心肌梗死、慢性充血性心力衰竭、心房顫動(dòng)、高血壓心臟損害、糖尿病性心肌病變、心肌病及心肌炎等,都伴有心肌重構(gòu)的病理過(guò)程,而心肌纖維化(MF)是心肌重構(gòu)的重要環(huán)節(jié),切實(shí)有效的防治MF受到高度關(guān)注[1]。葛根素(Pue)為異黃酮類藥物,系豆科植物野葛干燥根中的提取物,臨床用于治療多種心血管疾病。本研究探討葛根素對(duì)異丙腎上腺(ISO)誘導(dǎo)的MF模型小鼠左心室Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)表達(dá)的影響,對(duì)闡述葛根素和MF的關(guān)系有一定理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品與動(dòng)物

倒置顯微鏡XDS-1B型(重慶光學(xué)儀器廠);722型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DS-671電子秤(上海寺岡電子有限公司);80-2型臺(tái)式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司);PK-S22電熱恒溫水浴鍋(上海精宏儀器設(shè)備有限公司);MR23i高速冷凍離心機(jī)(法國(guó)Jouan公司);MyCycler TM型PCR儀(美國(guó)Biorad公司)。葛根素(蘇州長(zhǎng)征制藥廠饋贈(zèng),純度≥99%,批號(hào):080301);卡托普利(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號(hào):0810031);異丙腎上腺素(ISO)(上海禾豐制藥有限公司,批號(hào):080701);羥脯氨酸(Hydro)試劑盒(南京建成生物公司,批號(hào):20081202)。其余試劑為分析純。CollagenⅠ引物購(gòu)自上海生工科技公司。清潔級(jí)昆明種雄性小鼠(蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體質(zhì)量22～25 g。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法及造模:葛根素低劑量(600 mg/kg)組、葛根素高劑量(1200 mg/kg)組及陽(yáng)性藥對(duì)照(卡托普利,25 mg/kg)組預(yù)先在上午灌胃給藥3d后,同時(shí)在下午皮下注射ISO 5 mg/kg 1 d,后以2.5 mg/kg維持至30 d。停止注射ISO后,再繼續(xù)給藥1周。MF模型組以ISO5 mg/kg皮下注射1 d后,以2.5 mg/kg維持至30 d;溶媒對(duì)照組上午以0.5%的CMC-Na灌胃(葛根素用0.5%的CMC-Na溶液配制),3 d后在下午同時(shí)皮下注射生理鹽水至30 d。停止注射生理鹽水后,再繼續(xù)以0.5%的CMC-Na灌胃1周。

1.2.2 心重指數(shù)(CWI)測(cè)定:末次給藥后次日,5組小鼠稱重,頸椎脫臼處死小鼠,取小鼠心臟,稱重,計(jì)算CWI。

1.2.3 Hydro含量測(cè)定:采用消化法檢測(cè)小鼠心肌組織Hydro含量,組織中的膠原經(jīng)酶消化產(chǎn)生Hydro,Hydro在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色,在550 nm測(cè)定Hydro含量,具體操作按照Hydro測(cè)定試劑盒?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白含量,具體操作按照總蛋白測(cè)定試劑盒。

1.2.4 CollagenⅠ mRNA測(cè)定:左心室勻漿后,用TRIzol提取總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。CollagenⅠ的引物:上游 5′-ACGTCCTGGTGAAGTT GGTC-3′,下 5′-CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為169 bp,退火溫度為55℃。GAPDH 的引物:上游5′-GTATGACGTGGAGTC TACTG-3′, 下游 5′-TACTCCTTGGAGGCCATG TA-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為728bp,退火溫度為56℃。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳,結(jié)果經(jīng)凝膠掃描圖像處理系統(tǒng)分析,以CollagenⅠ基因擴(kuò)增帶灰度與同管擴(kuò)增的GAPDH基因擴(kuò)增帶灰度之比表示CollagenⅠmRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)CWI和心肌Hydro含量的影響

CWI按照“CWI(mg/g)=全心質(zhì)量/體質(zhì)量”計(jì)算。Hydro含量按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的公式計(jì)算。結(jié)果顯示,與溶媒對(duì)照組相比,模型組CWI和Hydro含量明顯增加(P<0.01);與模型組相比,葛根素給藥組均可降低CWI和Hydro含量,其中CWI降低了7.12%～10.15%,Hydro含量降低了18.28%～19.53%(P<0.05或P<0.01)。陽(yáng)性藥卡托普利組與模型組比較,CWI和Hydro含量也明顯降低(P<0.01),見(jiàn)表1。

表1 葛根素對(duì)ISO誘導(dǎo)MF小鼠CWI、Hydro含量和CollagenⅠmRNA表達(dá)的影響(,n=8)

表1 葛根素對(duì)ISO誘導(dǎo)MF小鼠CWI、Hydro含量和CollagenⅠmRNA表達(dá)的影響(,n=8)

與溶媒對(duì)照組比較,＊P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 劑量(mg·kg-1) CWI(mg·g-1) Hydro(mg·g-1protein) CollagenⅠmRNA溶媒對(duì)照組3.75±0.17 4.58±0.51 0.21±0.03模型組 4.63±0.36＊ 5.58±0.63＊ 1.45±0.23＊葛根素低劑量組 600 4.30±0.21# 4.56±0.30## 0.98±0.21##葛根素高劑量組 1200 4.16±0.10## 4.49±0.86## 0.46±0.08##卡托普利組 25 4.20±0.37# 4.45±0.85## 0.65±0.07##

2.2 對(duì)左心室CollagenⅠmRNA表達(dá)的影響

模型組CollagenⅠmRNA表達(dá)明顯增加,與正常對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01);葛根素給藥組與模型組比較,CollagenⅠmRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。陽(yáng)性藥卡托普利組與模型組比較,CollagenⅠmRNA表達(dá)也明顯降低(P<0.01),見(jiàn)表1。

3 討 論

MF涉及的病因較多,不同病因所致膠原和心肌重構(gòu)的具體機(jī)制不盡相同。從總體上講,心肌膠原的異常蓄積是膠原生成大于膠原降解的結(jié)果,膠原生成與降解之間的動(dòng)態(tài)平衡,涉及一系列的調(diào)控因素,而且這些因素之間存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的相互依存與相互制約關(guān)系。一旦這種平衡被破壞,膠原產(chǎn)生增多或降解減少,均可使膠原過(guò)多沉積,其中主要以CollagenⅠ為主,導(dǎo)致心室順應(yīng)性下降,影響心臟的正常收縮與舒張功能[2]。

本實(shí)驗(yàn)采用ISO誘導(dǎo)小鼠MF,表現(xiàn)為CWI,心肌Hydro含量明顯增加,結(jié)果證明在小鼠身上成功的復(fù)制了ISO致MF的模型,改造模方法接近疾病進(jìn)程,且相對(duì)無(wú)創(chuàng)、動(dòng)物死亡率低,與其他文獻(xiàn)的報(bào)道相一致[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用葛根素預(yù)防給藥,可見(jiàn)MF小鼠的CWI、心肌 Hydro含量明顯降低,說(shuō)明葛根素能減輕MF的發(fā)展。RTPCR方法顯示,用葛根素預(yù)防給藥的MF小鼠左心室中CollagenⅠmRNA水平明顯降低,由此推測(cè),葛根素預(yù)防ISO誘導(dǎo)的小鼠MF的作用可能與抑制CollagenⅠ的表達(dá)有關(guān),具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]Cohn J N,Ferrari R,Sharpe N.Cardiac remodeling-concepts and clinical implications:a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.Behalf of an International Forum on Cardiac Remo deling[J].J Am Coll Cardiol,2000,35(3):569.

[2]徐冬玲,劉偉華,杜貽盟,等.PPARγ在糖尿病心肌纖維化大鼠心肌細(xì)胞及微血管內(nèi)皮中的表達(dá)[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào),2008,46(9):847.

[3]李明,張軍,陳燕,等.丹參抑制異丙腎上腺素引起的小鼠心肌肥厚和纖維化及其作用機(jī)制[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,34(6):565.

[4]鄧瑋,陳慶偉,李興升,等.小鼠心肌纖維化模型的制備及其膠原沉積的機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2011,19(2):103.