畢娟娟， 何 林， 余 音， 郭 倩， 葉秀峰,2△

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1神經(jīng)科學(xué)研究中心，2病理教研室，重慶 400016)

1000-4718(2012)04-0601-07

2011-11-18

2012-02-21

重慶市教委科技研究項(xiàng)目基金資助項(xiàng)目(No.KJ08032)；重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.CSCT，2008AB5118)

△通訊作者 Tel：023-68485789； E-mail:Yxf1960@126.com

自噬在熊果酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用*

畢娟娟1， 何 林1， 余 音1， 郭 倩1， 葉秀峰1,2△

(重慶醫(yī)科大學(xué)1神經(jīng)科學(xué)研究中心，2病理教研室，重慶 400016)

目的研究自噬在熊果酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷中的作用。方法體外培養(yǎng)HUVECs，運(yùn)用不同濃度的熊果酸處理36 h，采用MTT法檢測(cè)HUVECs增殖率的變化；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染色觀察熊果酸對(duì)HUVECs自噬表達(dá)水平的影響；Western blotting檢測(cè)微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的變化；RT-PCR檢測(cè)LC3及Beclin-1 mRNA的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine， 3-MA)抑制自噬前后經(jīng)熊果酸處理的HUVECs凋亡率的變化。結(jié)果熊果酸抑制HUVECs增殖并呈劑量依賴性；熊果酸可誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生自噬：透射電鏡和MDC染色均顯示HUVECs經(jīng)熊果酸處理后自噬囊泡明顯增加且自噬在基因及蛋白水平的表達(dá)均增加；3-MA與熊果酸聯(lián)合作用于HUVECs時(shí)抑制了熊果酸誘導(dǎo)的HUVECs自噬空泡的積聚并且可明顯促進(jìn)HUVECs凋亡。結(jié)論熊果酸抑制HUVECs增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，自噬在此過程中對(duì)HUVECs起保護(hù)作用。自噬抑制劑3-MA能夠增強(qiáng)熊果酸誘導(dǎo)的HUVECs的增殖抑制作用并且促進(jìn)HUVECs發(fā)生凋亡。

熊果酸； 內(nèi)皮細(xì)胞； 自吞噬作用； 細(xì)胞凋亡

病理性血管生成具有持續(xù)性、無控性，其在腫瘤的演化過程中起著重要的作用。腫瘤新生血管對(duì)其提供氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)則作為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的首要步驟，因此，目前治療腫瘤的焦點(diǎn)已匯集于抑制腫瘤血管生成[1]。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的降解途徑。眾多研究表明自噬在疾病發(fā)生及發(fā)展過程中具有促進(jìn)和抑制的雙重作用：自噬能夠在饑餓及外界刺激下回收大分子以及清除受損的線粒體及其它細(xì)胞器，為細(xì)胞提供能量及蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)再循環(huán)以維持細(xì)胞生存。然而，自噬也可以引起細(xì)胞生長阻滯，以及一種與過量自噬空泡形成有關(guān)的自噬性細(xì)胞死亡[2]。

熊果酸(ursolic acid，UA)又稱烏索酸或?yàn)跆K酸，一種來源于傳統(tǒng)中草藥的提取物,屬五環(huán)三萜類化合物。它廣泛存在于自然界中，并具有多種生物學(xué)效應(yīng)，比如抗腫瘤、抗血管生成、抗氧化、抗抑郁、保肝、降血脂、抗病毒及抗菌作用等，且毒副作用較小[3]。 Sohn 等[4]雞胚胎絨毛膜實(shí)驗(yàn)(chicken chorioallantoicmembrane assays，CAM)研究顯示，熊果酸可較強(qiáng)地抑制血管生成，但其作用機(jī)制目前尚未明確。我們之前研究表明熊果酸可通過抑制ERK信號(hào)通路抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[5]。目前，關(guān)于自噬在熊果酸誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用報(bào)道較少，本文利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)協(xié)同作用，初步探討自噬在熊果酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)株由重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供。

2主要試劑

熊果酸(純度>98%)購自陜西旭煌植物科技發(fā)展有限公司；DMEM/high glucose購自HyClone；小牛血清購自Gibco;3-MA、單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)、Western Blotting Luminol Reagent和兔抗人微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)多克隆抗體購自Sigma；MTT購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PRO-PREPTM蛋白提取液購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；兔抗人Beclin-1多克隆抗體購自Santa Cruz；小鼠抗人β-actin、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DNA marker 購自Bioflux；RNA提取試劑盒購自TaKaRa；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；Taq酶購自SinoBio。

3細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs置于含15%小牛血清的DMEM/high glucose培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4MTT法檢測(cè)熊果酸對(duì)HUVECs增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長期的HUVECs，以5 000 cells/well的密度接種于96 孔板，每孔加200 μL培養(yǎng)基，于孵箱中培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為熊果酸組(分別加入5、10、20、40、80 μmol/L熊果酸)；3-MA+熊果酸處理組(先用2 mmol/L 3-MA預(yù)處理細(xì)胞，1 h后加入不同濃度熊果酸)；溶劑對(duì)照組(只加相應(yīng)濃度DMSO不加熊果酸)和空白調(diào)零組(只含培養(yǎng)液，無細(xì)胞)，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。作用36 h后，每孔加入MTT(5 g/ L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯(lián)免疫測(cè)定儀選擇波長570 nm空白孔調(diào)零,測(cè)定各孔吸光度(A)值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[ (溶劑對(duì)照組A值-處理組A值)/溶劑對(duì)照組A值] ×100 %。

5透射電鏡法檢測(cè)熊果酸對(duì)HUVECs細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

取對(duì)數(shù)生長期HUVECs，以每瓶5×105的密度接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶加5 mL培養(yǎng)液。熊果酸(20 μmol/L)給藥 36 h后常規(guī)收集細(xì)胞，正常對(duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h。PBS離心洗滌1次，1 000 r/min離心10 min, 4%戊二醛固定，于 4 ℃保存，送重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室固定、切片、攝片。

6MDC熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬空泡的變化

MDC是自噬空泡的標(biāo)志物，通過MDC染色可以觀察判斷細(xì)胞自噬過程的發(fā)生[6]。取對(duì)數(shù)生長期HUVECs，以2×104/well的密度接種于已放置小蓋玻片的24孔板中，每孔加1 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后加入終濃度為20 μmol/L熊果酸，另設(shè)3-MA(2 mmol/L)+熊果酸(20 μmol/L)處理組和正常對(duì)照組。置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。36 h后加入終濃度50 μmol/L MDC，37 ℃孵育60 min，PBS液漂洗5 min×3次。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，PBS液漂洗5 min×3次，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬空泡的變化并統(tǒng)計(jì)熒光染色陽性細(xì)胞百分比。

7Westernblotting檢測(cè)LC3和Beclin-1蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期的HUVECs以每瓶5×105的密度接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶加5 mL培養(yǎng)液，24 h后按如下分組進(jìn)行處理: 20 μmol/L熊果酸分別處理0、12、24、36、48 h。取各組細(xì)胞，提取總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5 kg/L脫脂奶粉37℃封閉1 h；加入5%脫脂奶粉稀釋的兔抗人LC3(1∶1 000 稀釋)或兔抗人Beclin-1(1∶200稀釋)多克隆抗體或小鼠抗人β-actin 單克隆抗體(1∶500 稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜后，加入5%脫脂奶粉稀釋、HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(1∶1 000 稀釋)，37 ℃孵育2 h；ECL顯色，采用ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光采圖。用Quantity One 4.6.2 軟件分析，比較條帶的面積和灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量。

8RT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1mRNA的表達(dá)

8.1分組 取對(duì)數(shù)生長期的HUVECs以每瓶5×105的密度接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶加5 mL培養(yǎng)液，24 h后按如下分組進(jìn)行處理：(1)20 μmol/L熊果酸分別處理0、12、24、36、48 h；(2)熊果酸(20 μmol/L)組、3-MA(2 mmol/L)+熊果酸(20 μmol/L)組和正常對(duì)照組(正常培養(yǎng)細(xì)胞)。

8.2引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)Gene中登錄的LC3及Beclin-1序列設(shè)計(jì)引物：LC3上游引物5′-TCCCACACCAAGTGCATGTCAG-3′，下游引物 5′-GCCAAGTGGACAGACGCATGC-3′，擴(kuò)增片段長度為390 bp；Beclin-1上游5′-GGTGGCTTTCCTGGACTGTGTGC-3′，下游引物5′-TCAAAACTGACCAGGGCTGGCA-3′,擴(kuò)增片段長度為465 bp；內(nèi)參照β-actin 上游引物5′-CCGCCAGCTCACCATGGATGAT-3′，下游引物5′-TCTCTTGCTCTGGGCCTCTG-3′,擴(kuò)增片段長度為199 bp，由北京賽百盛公司合成。

8.3細(xì)胞總RNA 的提取 取各組細(xì)胞，PBS洗滌2次后加入Trizol提取液，以氯仿/異丙醇法抽提各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定A260/A280比值。

8.4RT-PCR 以提取的細(xì)胞總RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參照。反應(yīng)體系：Taq酶12.5 μL、上、下游引物各1 μL ,cDNA2.5 μL,用滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至25 μL。LC3反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35 個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min。Beclin-1反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35 個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并計(jì)算LC3、Beclin-1 mRNA/β-actin吸光度值。

9流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長期HUVECs，以每瓶5×105的密度接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶加5 mL培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后加入20 μmol/L熊果酸，另設(shè)3-MA(2 mmol/L) +熊果酸(20 μmol/L)處理組、正常對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)36 h后常規(guī)收集細(xì)胞， PBS液沖洗,1 000 r/min離心5 min×3次。送重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院annexin V-FITC和PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1熊果酸對(duì)HUVECs增殖的影響

不同濃度熊果酸(5、10、20、40、80 μmol/L)作用HUVECs 36 h后均有抑制作用，且呈明顯的劑量依賴性，不同濃度與對(duì)照組(0 μmol/L)之間的抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，熊果酸處理HUVECs 36 h的IC50為20 μmol/L，以下相關(guān)實(shí)驗(yàn)選用的藥物濃度為20 μmol/L，見圖1。

圖1不同濃度熊果酸對(duì)HUVECs增殖的抑制率

2熊果酸可誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生自噬

2.1透射電鏡觀察熊果酸對(duì)HUVECs超微結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組細(xì)胞核膜完整，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，胞漿內(nèi)各細(xì)胞器、細(xì)胞核形態(tài)和分布基本正常，未見明顯自噬空泡，溶酶體數(shù)目未見明顯增多。熊果酸(20 μmol/L)處理36 h后胞漿中可見大量空泡狀結(jié)構(gòu)及包含部分胞漿成分形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體,表明熊果酸可誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生自噬，見圖2。

2.2Western blotting檢測(cè)LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)情況 20 μmol/L熊果酸處理HUVECs后，結(jié)果顯示：隨著作用時(shí)間的延長LC3Ⅱ/LC3Ⅰ逐漸增高，除48 h外各時(shí)間組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著作用時(shí)間的延長Beclin-1蛋白表達(dá)增高，除12 h外各時(shí)間組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

Figure 2. The effect of ursolic acid (UA) on ultrastructure of HUVECs. A:control; B: UA.

圖2熊果酸對(duì)HUVECs細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3RT-PCR檢測(cè)LC3和Beclin-1 mRNA表達(dá)情況 20 μmol/L熊果酸處理HUVECs后，結(jié)果顯示：隨著作用時(shí)間的延長LC3 mRNA表達(dá)逐漸增高，于36 h達(dá)高峰，各時(shí)間組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著作用時(shí)間的延長Beclin-1 mRNA表達(dá)增高，除12 h組外，各時(shí)間組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

3抑制自噬增強(qiáng)了熊果酸對(duì)HUVECs的增殖抑制作用

3.1MDC熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬空泡的變化 MDC染色結(jié)果顯示單獨(dú)應(yīng)用熊果酸作用于HUVECs時(shí)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯自噬空泡積聚，陽性細(xì)胞率為(67.12±2.85)%，與正常對(duì)照組陽性細(xì)胞率[(5.37±1.34)%]相比有明顯差異，表明有自噬發(fā)生；熊果酸與3-MA聯(lián)合作用(24.07±0.60)%時(shí)，自噬空泡明顯減少但仍高于正常對(duì)照組，表明自噬被抑制，見圖5。

圖320μmol/L熊果酸處理不同時(shí)間HUVECs中LC3及Beclin-1蛋白的表達(dá)

3.2RT-PCR檢測(cè)3-MA對(duì)熊果酸誘導(dǎo)的HUVECs LC3和Beclin-1 mRNA表達(dá)的影響 20 μmol/L熊果酸單獨(dú)處理或2 mmol/L 3-MA與20 μmol/L熊果酸聯(lián)合處理的HUVECs中， LC3和Beclin-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常對(duì)照組，其中熊果酸單獨(dú)處理組高于3-MA與熊果酸聯(lián)合處理組，差異顯著(P<0.05)，見圖6。

3.33-MA對(duì)熊果酸抑制HUVECs增殖的影響 MTT結(jié)果顯示：熊果酸單獨(dú)作用HUVECs或3-MA與熊果酸聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞增殖均有抑制作用,后者抑制作用更為顯著，其細(xì)胞存活率差異顯著(P<0.05)；3-MA 與對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖7。

4抑制自噬能促進(jìn)熊果酸誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的發(fā)生

與正常對(duì)照組[細(xì)胞凋亡率(3.34±0.32)%]相比，熊果酸單獨(dú)作用HUVECs 36 h,細(xì)胞凋亡率增加[ (5.21±0.22)%]；3-MA和熊果酸聯(lián)合作用時(shí)與單獨(dú)應(yīng)用熊果酸組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加[(12.7±0.56)%]，見圖8。

圖420μmol/L熊果酸處理不同時(shí)間HUVECs中LC3及Beclin-1mRNA的表達(dá)

圖5MDC染色檢測(cè)熊果酸和3-MA作用36hHUVECs自噬空泡的變化

討 論

腫瘤血管生成是導(dǎo)致腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因素。近年來通過抑制腫瘤血管生成進(jìn)而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)抗腫瘤血管生成主要是通過抑制血管生成因子的產(chǎn)生、抑制配基與受體相互作用而抑制血管生成因子的活性、選擇性拮抗劑直接作用于血管生長因子受體，調(diào)節(jié)受體在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)水平或者引入野生型受體與負(fù)性非功能受體與之競(jìng)爭(zhēng)、抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及分化成新生血管的能力、抑制或者中和具有降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)酶的活性[7]。但由于大多數(shù)抗血管生成藥物具有不穩(wěn)定性、毒性較大且價(jià)格昂貴 ，因此臨床應(yīng)用受到限制。熊果酸作為一種高效低毒的天然藥物，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，具有廣闊應(yīng)用前景，有望成為一種新型抗腫瘤藥物[8-9]。已有報(bào)道熊果酸可通過多種途徑抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[10-11]。

自噬在疾病進(jìn)展中的角色隨疾病病程不斷發(fā)生變化，細(xì)胞受到外界刺激發(fā)生自噬時(shí)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量游離的膜性結(jié)構(gòu)，逐漸包繞受損傷細(xì)胞器和部分胞漿形成自噬體，之后再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝。自噬在很多情況下都可以被激活，當(dāng)營養(yǎng)缺乏或者各種生存條件不足時(shí)細(xì)胞可通過自噬降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)為細(xì)胞提供營養(yǎng)及能量實(shí)現(xiàn)再循環(huán)。因此，從這個(gè)意義上講自噬是細(xì)胞面對(duì)不良刺激時(shí)所發(fā)生的一種防御行為[12]。然而，自噬具有兩面性，一方面可通過降解有害物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞以避免壞死和凋亡的危險(xiǎn)，而過度的激活則會(huì)通過降解細(xì)胞器導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究表明：自噬在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起一定的保護(hù)作用，抑制自噬會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用[13]；另有研究報(bào)道抑制自噬可促進(jìn)Nara-H細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。熊果酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中是否誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，自噬在此過程中起保護(hù)作用還是抑制作用則成為本課題研究的重點(diǎn)。

圖63-MA對(duì)熊果酸誘導(dǎo)的LC3和Beclin-1mRNA表達(dá)的影響

圖73-MA對(duì)熊果酸誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞生存率的影響

本研究通過MTT檢測(cè)證明熊果酸對(duì)HUVECs具有細(xì)胞毒作用，并呈明顯的劑量依賴性；透射電鏡下觀察到經(jīng)熊果酸處理的HUVECs胞漿中可見明顯的自噬體及自噬溶酶體，與文獻(xiàn)中描述的自噬過程出現(xiàn)的空泡一致[15]。Atg為自噬相關(guān)蛋白，LC3為Atg8在哺乳動(dòng)物中的同源體。Atg12結(jié)合過程和LC3修飾過程在哺乳動(dòng)物自噬泡形成過程中起著重要的作用。Atg12結(jié)合過程參與前自噬泡的形成，LC3具有2種形式：LC3-I 和LC3-II。LC3前體形成后,在 Atg7 的催化作用下發(fā)生一系列反應(yīng)：首先加工成胞漿可溶性形式的 LC3-I，隨后，LC3-I 被活化并轉(zhuǎn)運(yùn)至 Atg3，并被修飾成膜結(jié)合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬體和自噬體，其為自噬體的標(biāo)志分子。一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)的LC3- II便被溶酶體中的水解酶降解。 LC3-II含量或 LC3-II/LC3-I 的比值與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)[16]。因此，通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3-II 的含量變化，可以基本判斷是否發(fā)生自噬及其自噬是被誘導(dǎo)還是被抑制。本實(shí)驗(yàn)Western blotting顯示熊果酸處理HUVECs后與對(duì)照組相比, LC3-II/LC3-I 的比值明顯增加。同時(shí)，RT-PCR檢測(cè)顯示HUVECs經(jīng)熊果酸處理后與對(duì)照組相比LC3 mRNA表達(dá)明顯增多。則從另一個(gè)角度說明熊果酸在抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的過程中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。MDC熒光染色發(fā)現(xiàn)單純熊果酸作用于HUVECs后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬空泡積聚，而自噬特異性抑制劑3-MA與熊果酸聯(lián)合作用后細(xì)胞內(nèi)自噬空泡明顯減少，明顯抑制了自噬的發(fā)生。我們同時(shí)經(jīng)RT-PCR證實(shí)了這一點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)：3-MA能夠一定程度地抑制H2O2誘導(dǎo)的U251細(xì)胞發(fā)生自噬并且促進(jìn)其發(fā)生凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，我們通過MDC、RT-PCR、檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3-MA與熊果酸聯(lián)合作用組自噬相關(guān)基因表達(dá)較熊果酸單獨(dú)處理組明顯降低，同時(shí)MTT法檢測(cè)顯示抑制自噬后熊果酸誘導(dǎo)的HUVECs增殖抑制明顯增強(qiáng)；且抑制自噬可以促進(jìn)熊果酸誘導(dǎo)的HUVECs發(fā)生凋亡。

圖83-MA對(duì)熊果酸誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響

綜上所述，熊果酸在抑制HUVECs增殖過程中可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，自噬在此過程中對(duì)HUVECs起保護(hù)作用。抑制自噬，可增強(qiáng)熊果酸對(duì)HUVECs的抑制作用且促進(jìn)HUVECs發(fā)生凋亡。

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Roleofautophagyinursolicacid-inducedinjuryofhumanumbilicalveinendothelialcells

BI Juan-juan1, HE Lin1, YU Yin1, GUO Qian1, YE Xiu-feng1，2

(1InstituteofNeuroscience,2DepartmentofPathology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:Yxf1960@126.com)

AIM: To investigate the role of autophagy in the injury of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by ursolic acid (UA).METHODSHUVECs were culturedinvitrowith UA at various concentrations for 36 h and the proliferation inhibitory rate of HUVECs was determined by MTT method. The change of ultrastructure was observed under transmission electronic microscope (TEM). The autophagy was observed using fluorescent microscope by monodansylcadaverin (MDC) staining. The protein level and mRNA expression of microtubule-associated protein light chain 3(LC3) and Beclin-1 were detected by Western blotting and RT-PCR, respectively. Cell apoptotic rate was measured by flow cytometry analysis.RESULTSUA at various concentrations showed significantly dose-dependent inhibitory effect on the proliferation of HUVECs. Autophagy was induced in HUVECs treated with UA as detected by MDC staining and TEM. The protein level and mRNA expression of LC3 and Beclin-1 in HUVECs were significantly increased following the treatment with UA, which was also in a time-dependent manner. Compared with UA group, addition of 3-methyladenine(3-MA) inhibited the increase in autophagic vacuoles and exacerbated the apoptosis.CONCLUSIONAutophagy shows protective effect on the proliferation inhibition of HUVECs induced by UA and the proliferation inhibition can be enhanced by the autophagy inhibitor 3-MA. 3-MA may enhance the apoptotic rate of HUVECs induced by UA.

Ursolic acid; Endothelial cells; Autophagy; Apoptosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.005