王 榮，校 鑫，林 瑤，張 磊，王曉娟*

（1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院藥劑科，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032）

皂苷是廣泛存在于自然界的一類(lèi)活性物質(zhì)，其抗腫瘤作用一直是研究的熱點(diǎn)。研究表明，皂苷抗腫瘤作用的靶點(diǎn)和途徑廣泛多樣，有很好的研究和開(kāi)發(fā)前景［1］。

九節(jié)龍?jiān)碥?(Ardipusilloside，ADS)是本課題組最早從川產(chǎn)九節(jié)龍Ardisia pusilla A.DC中分離得到的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的先導(dǎo)化合物，該化合物具有抗腫瘤作用［2-3］，特別是對(duì)腦膠質(zhì)瘤具有明顯的抑制作用［4-8］，可引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，且不影響腦內(nèi)正常支持細(xì)胞，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景，已獲專利4項(xiàng)。在原有的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，對(duì)九節(jié)龍毛苷進(jìn)行了一系列的結(jié)構(gòu)修飾，經(jīng)過(guò)MTT法篩選，九節(jié)龍?jiān)碥招揎椢顰DS003較九節(jié)龍?jiān)碥沼懈玫目鼓[瘤效果。本實(shí)驗(yàn)擬觀察ADS003對(duì)體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞的抑制作用，從分子水平探討其抑瘤作用機(jī)制；并通過(guò)建立裸鼠移植瘤模型，考察ADS003對(duì)瘤體以及caspase表達(dá)的影響，從體內(nèi)外探討ADS003的抑瘤作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍神經(jīng)外科研究所提供。于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素、0.37%NaHCO3、0.42%Heppes的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA(ethylenediamineetraacetic acid)消化傳代。

1.2 藥品、試劑及儀器 九節(jié)龍?jiān)碥昭苌?03［(ADS003)，自制，純度＞92%］；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)；胎牛血清 (美國(guó)Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍(lán) (methyl thiazolylterrazaium，MTT)(美國(guó)Sigma公司)；兔抗Caspase3、Pho-Caspase3單抗、山羊抗兔二抗 (美國(guó)Santa ctruz公司)；DAB顯色液 (北京中衫公司)。

CO2培養(yǎng)箱 (美國(guó)Thermo公司)；空氣凈化臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；酶聯(lián)儀、電泳儀 (美國(guó)Bio-Red公司)；凝膠成像系統(tǒng) (美國(guó)Alpha Innotech公司)；雙速恒溫振蕩器 (太倉(cāng)市科教器材廠)；低溫高速離心機(jī) (美國(guó)Beckman公司)；pH值測(cè)定儀 (德國(guó)Sartorius公司)。

1.3 動(dòng)物 成年雄性BALB/c裸鼠(6周，25 g)，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)ADS003對(duì)U373細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U373細(xì)胞，稀釋成2×104/mL的單細(xì)胞懸液，接種至96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，吸取陪養(yǎng)液、棄掉，加入含不同ADS003質(zhì)量濃度 (2、4、8、16、32、64、100 mg/L)的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、48、72 h。隨后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取上清、棄掉，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min。酶標(biāo)分析儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的光密度值。抑制率 (%)=(A對(duì)照組－A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組×100%。

2.2 流式細(xì)胞術(shù) (flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)凋亡細(xì)胞 將U373細(xì)胞接種于4個(gè)100 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液換成含ADS003的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化細(xì)胞，加入含血清的完全培養(yǎng)基。輕微吹打使細(xì)胞脫壁，500 r/min離心5 min收集細(xì)胞，吸取上清、棄掉，用PBS洗滌細(xì)胞2次。后續(xù)步驟按照Annexin V FITC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡水平。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U373細(xì)胞，稀釋成2×104/mL的單細(xì)胞懸液，接種至放有蓋玻片的6孔板內(nèi)。細(xì)胞帖壁后，吸取培養(yǎng)液、棄掉，加入含ADS003培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后用PBS清洗3次，0.3%的 H2O2封閉20 min，加入Triton-100(0.15%)破膜10 min，PBS清洗3次，加入一抗4℃過(guò)夜，加入二抗，按DAB操作步驟過(guò)缸，樹(shù)膠封片。結(jié)果判讀以胞漿被染成棕色判為陽(yáng)性細(xì)胞。每張片子隨機(jī)選擇8個(gè)視野，采用image pro plus 6.0分析灰度值。

2.4 實(shí)體瘤動(dòng)物模型的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U373細(xì)胞，消化，獲得單細(xì)胞懸液，檢測(cè)細(xì)胞活率達(dá)95%～98%。離心沉淀細(xì)胞，生理鹽水重懸，調(diào)節(jié)密度至5×107個(gè)/mL。成年雄性BALB/c裸鼠40只，碘仿消毒，每只100 μL，接種于裸鼠背部皮下，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 接種后，待瘤塊長(zhǎng)徑為10 mm左右，將成瘤的40只裸鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組，ADS003低、中、高劑量組 (12.5 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg)，每組10只。次日 (d1)開(kāi)始給藥，藥物均以生理鹽水稀釋，灌胃給藥，每3日1次，以游標(biāo)卡尺分別測(cè)量瘤塊長(zhǎng)徑 (a)和短徑 (b)，計(jì)算體積 (v)=a×b2/2。藥后15 d，處死，剝離瘤塊，稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率［9］。

2.6 免疫組織化學(xué) 取瘤塊，制作蠟塊，切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。用甲醇新鮮配制的0.3%雙氧水滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。10%正常山羊血清封閉液37℃溫育30 min，滴加稀釋后的一抗4℃過(guò)夜，加入二抗，按DAB操作步驟過(guò)缸，樹(shù)膠封片。顯微鏡觀察并照相。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件計(jì)算均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行方差分析，組間差異采用Dunnett-t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示。

3 結(jié)果

3.1 ADS003對(duì)U373細(xì)胞的細(xì)胞毒性 不同質(zhì)量濃度ADS003對(duì)U373細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用如圖1所示，隨著ADS003質(zhì)量濃度的增加，對(duì)U373細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)；隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ADS003對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用也呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)。

圖1 不同質(zhì)量濃度九節(jié)龍?jiān)碥蘸铣晌飳?duì)U373細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 The inhibit effect on proliferation of U373 cells treated with different concentrations of ADS003

3.2 FCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用FCM定量分析正常對(duì)照組和ADS003處理24 h后U373細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果如表1所示，與正常U373細(xì)胞相比，ADS003處理組隨質(zhì)量濃度增加U373細(xì)胞凋亡率明顯增加(P ＜0.01)。

3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ADS003作用24 h后，腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞中Caspase3、p-Caspase3均在胞漿中高表達(dá)，并隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表達(dá)增加，與陰性對(duì)照組比較，有顯著差異 (P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表1 九節(jié)龍?jiān)碥昭苌镫S質(zhì)量濃度變化對(duì)U373細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 Effects of ADS003 on the apoptosis of U373 cells()

表1 九節(jié)龍?jiān)碥昭苌镫S質(zhì)量濃度變化對(duì)U373細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 Effects of ADS003 on the apoptosis of U373 cells()

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與對(duì)照組相比，#P＜0.01。

組 別 質(zhì)量濃度/(mg·L－1)細(xì)胞樣本數(shù)/個(gè)OD值 細(xì)胞凋亡率/%陰性對(duì)照組 － 6 0.876±0.03 －ADS003高劑量組 15.0 6 0.636±0.04 61.26*#ADS003中劑量組 10.0 6 0.437±0.03 49.98*#ADS003低劑量組 5.0 6 0.177±0.03 20.24*

表2 九節(jié)龍?jiān)碥昭苌镫S質(zhì)量濃度變化對(duì)Caspase3、p-Caspase3的免疫細(xì)胞化學(xué)的影響Tab.2 Effects of ADS003 on Caspase3 and p-Caspase3 expression()

表2 九節(jié)龍?jiān)碥昭苌镫S質(zhì)量濃度變化對(duì)Caspase3、p-Caspase3的免疫細(xì)胞化學(xué)的影響Tab.2 Effects of ADS003 on Caspase3 and p-Caspase3 expression()

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與對(duì)照組相比，#P＜0.01。

陰性對(duì)照組 － 8 0.1322±0.026 0.1155±0.029 ADS003高劑量組 15.0 8 0.4778±0.018 0.5320±0.018*#ADS003中劑量組 10.0 8 0.3021±0.034 0.3196±0.031*ADS003低劑量組5.0 8 0.1418±0.012 0.1321±0.022

3.4 對(duì)裸鼠移植性實(shí)體瘤模型的抑制作用 與對(duì)照組比較，ADS003在12.5～50 mg/kg能顯著抑制裸鼠荷瘤U373細(xì)胞的生長(zhǎng)，其抑瘤率45.9%～55.8%；ADS003能顯著抑制荷瘤鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度九節(jié)龍?jiān)碥昭苌飳?duì)裸鼠荷瘤U373細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Fig.2 The inhibit effect on proliferation of U373 cells bearing mice with different concentrations of ADS003

3.5 ADS003對(duì)裸鼠移植性實(shí)體瘤Caspase表達(dá)的影響 腫瘤組織經(jīng)DAB染色，細(xì)胞核染成淡藍(lán)色，Caspase3、p-Caspase3位于胞漿中，被染成褐色。如圖3、圖4所示。不同劑量ADS003作用后，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表達(dá)逐漸增加。

圖3 九節(jié)龍?jiān)碥昭苌飳?duì)裸鼠荷瘤U373細(xì)胞p-Caspase3表達(dá)的影響Tab.3 Effects of ADS003 on expression of Caspase3 and p-Caspase3 in U373 cells bearing mice

圖4 九節(jié)龍?jiān)碥昭苌飳?duì)裸鼠荷瘤U373 Caspase3表達(dá)的影響Tab.4 EffectsofADS003onexpressionofp-Caspase3 in U373 cells bearing mice

4 討論

通過(guò)對(duì)活性先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾發(fā)現(xiàn)新的活性成分是創(chuàng)制新藥的有效途徑之一［10］。本課題所采用的ADS003即是以九節(jié)龍?jiān)碥諡橄葘?dǎo)物，對(duì)其30位醛基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾所得的產(chǎn)物，前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該修飾物具有明顯的抗腫瘤活性。但其具體抗腫瘤分子機(jī)制還有待研究。

本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ADS003對(duì)腦膠質(zhì)瘤U373的抑制作用。體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞經(jīng)ADS003處理后，隨著藥物濃度的增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖受抑制的作用越明顯；隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性。FCM實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADS003可劑量依賴性的促進(jìn)U373細(xì)胞凋亡，免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ADS003誘發(fā)U373細(xì)胞凋亡與其促進(jìn)凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表達(dá)有關(guān)。通過(guò)對(duì)裸鼠移植性實(shí)體瘤模型研究發(fā)現(xiàn)，ADS003能抑制腫瘤生長(zhǎng)，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)ADS003給藥后，上調(diào)了Caspase3、p-Caspase3的表達(dá)。

腫瘤的發(fā)生是多因素相互作用、極其復(fù)雜的過(guò)程，而藥用植物中的活性成分可通過(guò)多種途徑、多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮其生物學(xué)作用，成為目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)［11］。ADS003是九節(jié)龍?jiān)碥盏男揎椢?，本?shí)驗(yàn)從體內(nèi)外兩方面證實(shí)了其抑瘤機(jī)理，ADS003能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈劑量依賴性；并能夠誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，這種作用機(jī)制極可能是通過(guò)上調(diào)促進(jìn)凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3，誘發(fā)U373細(xì)胞大量凋亡，發(fā)揮重要的抗腫瘤作用。綜上所述，上述研究結(jié)果為該藥進(jìn)一步的研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和立論依據(jù)。

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