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        九節(jié)龍皂苷衍生物對腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞株及裸鼠移植瘤的影響

        2012-11-01 14:08:00王曉娟
        中成藥 2012年11期
        關(guān)鍵詞:衍生物培養(yǎng)液膠質(zhì)瘤

        王 榮,校 鑫,林 瑤,張 磊,王曉娟*

        (1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院藥劑科,陜西 西安 710032;2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 西安 710032)

        皂苷是廣泛存在于自然界的一類活性物質(zhì),其抗腫瘤作用一直是研究的熱點(diǎn)。研究表明,皂苷抗腫瘤作用的靶點(diǎn)和途徑廣泛多樣,有很好的研究和開發(fā)前景[1]。

        九節(jié)龍皂苷 (Ardipusilloside,ADS)是本課題組最早從川產(chǎn)九節(jié)龍Ardisia pusilla A.DC中分離得到的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的先導(dǎo)化合物,該化合物具有抗腫瘤作用[2-3],特別是對腦膠質(zhì)瘤具有明顯的抑制作用[4-8],可引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,且不影響腦內(nèi)正常支持細(xì)胞,具有廣闊的開發(fā)前景,已獲專利4項(xiàng)。在原有的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,對九節(jié)龍毛苷進(jìn)行了一系列的結(jié)構(gòu)修飾,經(jīng)過MTT法篩選,九節(jié)龍皂苷修飾物ADS003較九節(jié)龍皂苷有更好的抗腫瘤效果。本實(shí)驗(yàn)擬觀察ADS003對體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞的抑制作用,從分子水平探討其抑瘤作用機(jī)制;并通過建立裸鼠移植瘤模型,考察ADS003對瘤體以及caspase表達(dá)的影響,從體內(nèi)外探討ADS003的抑瘤作用機(jī)理。

        1 材料和方法

        1.1 細(xì)胞株 膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍神經(jīng)外科研究所提供。于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素、0.37%NaHCO3、0.42%Heppes的DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA(ethylenediamineetraacetic acid)消化傳代。

        1.2 藥品、試劑及儀器 九節(jié)龍皂苷衍生物003[(ADS003),自制,純度>92%];DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司);胎牛血清 (美國Gibco公司);四甲基偶氮唑藍(lán) (methyl thiazolylterrazaium,MTT)(美國Sigma公司);兔抗Caspase3、Pho-Caspase3單抗、山羊抗兔二抗 (美國Santa ctruz公司);DAB顯色液 (北京中衫公司)。

        CO2培養(yǎng)箱 (美國Thermo公司);空氣凈化臺(蘇州凈化設(shè)備廠);酶聯(lián)儀、電泳儀 (美國Bio-Red公司);凝膠成像系統(tǒng) (美國Alpha Innotech公司);雙速恒溫振蕩器 (太倉市科教器材廠);低溫高速離心機(jī) (美國Beckman公司);pH值測定儀 (德國Sartorius公司)。

        1.3 動物 成年雄性BALB/c裸鼠(6周,25 g),購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 MTT法檢測ADS003對U373細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期U373細(xì)胞,稀釋成2×104/mL的單細(xì)胞懸液,接種至96孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h,吸取陪養(yǎng)液、棄掉,加入含不同ADS003質(zhì)量濃度 (2、4、8、16、32、64、100 mg/L)的培養(yǎng)液,培養(yǎng)24、48、72 h。隨后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸取上清、棄掉,每孔加入150 μL DMSO,震蕩10 min。酶標(biāo)分析儀檢測490 nm波長的光密度值。抑制率 (%)=(A對照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對照組×100%。

        2.2 流式細(xì)胞術(shù) (flow cytometry,F(xiàn)CM)檢測凋亡細(xì)胞 將U373細(xì)胞接種于4個100 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h,將培養(yǎng)液換成含ADS003的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化細(xì)胞,加入含血清的完全培養(yǎng)基。輕微吹打使細(xì)胞脫壁,500 r/min離心5 min收集細(xì)胞,吸取上清、棄掉,用PBS洗滌細(xì)胞2次。后續(xù)步驟按照Annexin V FITC試劑盒說明書進(jìn)行操作,用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡水平。

        2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期U373細(xì)胞,稀釋成2×104/mL的單細(xì)胞懸液,接種至放有蓋玻片的6孔板內(nèi)。細(xì)胞帖壁后,吸取培養(yǎng)液、棄掉,加入含ADS003培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后用PBS清洗3次,0.3%的 H2O2封閉20 min,加入Triton-100(0.15%)破膜10 min,PBS清洗3次,加入一抗4℃過夜,加入二抗,按DAB操作步驟過缸,樹膠封片。結(jié)果判讀以胞漿被染成棕色判為陽性細(xì)胞。每張片子隨機(jī)選擇8個視野,采用image pro plus 6.0分析灰度值。

        2.4 實(shí)體瘤動物模型的建立 取對數(shù)生長期的U373細(xì)胞,消化,獲得單細(xì)胞懸液,檢測細(xì)胞活率達(dá)95%~98%。離心沉淀細(xì)胞,生理鹽水重懸,調(diào)節(jié)密度至5×107個/mL。成年雄性BALB/c裸鼠40只,碘仿消毒,每只100 μL,接種于裸鼠背部皮下,飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

        2.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 接種后,待瘤塊長徑為10 mm左右,將成瘤的40只裸鼠隨機(jī)分為陰性對照組,ADS003低、中、高劑量組 (12.5 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg),每組10只。次日 (d1)開始給藥,藥物均以生理鹽水稀釋,灌胃給藥,每3日1次,以游標(biāo)卡尺分別測量瘤塊長徑 (a)和短徑 (b),計算體積 (v)=a×b2/2。藥后15 d,處死,剝離瘤塊,稱質(zhì)量,計算抑瘤率[9]。

        2.6 免疫組織化學(xué) 取瘤塊,制作蠟塊,切片,常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水。用甲醇新鮮配制的0.3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶,用0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。10%正常山羊血清封閉液37℃溫育30 min,滴加稀釋后的一抗4℃過夜,加入二抗,按DAB操作步驟過缸,樹膠封片。顯微鏡觀察并照相。

        2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件計算均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差,并進(jìn)行方差分析,組間差異采用Dunnett-t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示。

        3 結(jié)果

        3.1 ADS003對U373細(xì)胞的細(xì)胞毒性 不同質(zhì)量濃度ADS003對U373細(xì)胞生長的抑制作用如圖1所示,隨著ADS003質(zhì)量濃度的增加,對U373細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng);隨著藥物作用時間的延長,ADS003對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用也呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢。

        圖1 不同質(zhì)量濃度九節(jié)龍皂苷合成物對U373細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 The inhibit effect on proliferation of U373 cells treated with different concentrations of ADS003

        3.2 FCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用FCM定量分析正常對照組和ADS003處理24 h后U373細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果如表1所示,與正常U373細(xì)胞相比,ADS003處理組隨質(zhì)量濃度增加U373細(xì)胞凋亡率明顯增加(P <0.01)。

        3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ADS003作用24 h后,腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞中Caspase3、p-Caspase3均在胞漿中高表達(dá),并隨著藥物質(zhì)量濃度的增加,凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表達(dá)增加,與陰性對照組比較,有顯著差異 (P<0.01)。見表2。

        表1 九節(jié)龍皂苷衍生物隨質(zhì)量濃度變化對U373細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 Effects of ADS003 on the apoptosis of U373 cells()

        表1 九節(jié)龍皂苷衍生物隨質(zhì)量濃度變化對U373細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 Effects of ADS003 on the apoptosis of U373 cells()

        注:與對照組相比,*P<0.05;與對照組相比,#P<0.01。

        組 別 質(zhì)量濃度/(mg·L-1)細(xì)胞樣本數(shù)/個OD值 細(xì)胞凋亡率/%陰性對照組 - 6 0.876±0.03 -ADS003高劑量組 15.0 6 0.636±0.04 61.26*#ADS003中劑量組 10.0 6 0.437±0.03 49.98*#ADS003低劑量組 5.0 6 0.177±0.03 20.24*

        表2 九節(jié)龍皂苷衍生物隨質(zhì)量濃度變化對Caspase3、p-Caspase3的免疫細(xì)胞化學(xué)的影響Tab.2 Effects of ADS003 on Caspase3 and p-Caspase3 expression()

        表2 九節(jié)龍皂苷衍生物隨質(zhì)量濃度變化對Caspase3、p-Caspase3的免疫細(xì)胞化學(xué)的影響Tab.2 Effects of ADS003 on Caspase3 and p-Caspase3 expression()

        注:與對照組相比,*P<0.05;與對照組相比,#P<0.01。

        陰性對照組 - 8 0.1322±0.026 0.1155±0.029 ADS003高劑量組 15.0 8 0.4778±0.018 0.5320±0.018*#ADS003中劑量組 10.0 8 0.3021±0.034 0.3196±0.031*ADS003低劑量組5.0 8 0.1418±0.012 0.1321±0.022

        3.4 對裸鼠移植性實(shí)體瘤模型的抑制作用 與對照組比較,ADS003在12.5~50 mg/kg能顯著抑制裸鼠荷瘤U373細(xì)胞的生長,其抑瘤率45.9%~55.8%;ADS003能顯著抑制荷瘤鼠體質(zhì)量的增長(P<0.01)。見圖2。

        圖2 不同質(zhì)量濃度九節(jié)龍皂苷衍生物對裸鼠荷瘤U373細(xì)胞生長的抑制作用Fig.2 The inhibit effect on proliferation of U373 cells bearing mice with different concentrations of ADS003

        3.5 ADS003對裸鼠移植性實(shí)體瘤Caspase表達(dá)的影響 腫瘤組織經(jīng)DAB染色,細(xì)胞核染成淡藍(lán)色,Caspase3、p-Caspase3位于胞漿中,被染成褐色。如圖3、圖4所示。不同劑量ADS003作用后,隨著藥物質(zhì)量濃度的增加,凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表達(dá)逐漸增加。

        圖3 九節(jié)龍皂苷衍生物對裸鼠荷瘤U373細(xì)胞p-Caspase3表達(dá)的影響Tab.3 Effects of ADS003 on expression of Caspase3 and p-Caspase3 in U373 cells bearing mice

        圖4 九節(jié)龍皂苷衍生物對裸鼠荷瘤U373 Caspase3表達(dá)的影響Tab.4 EffectsofADS003onexpressionofp-Caspase3 in U373 cells bearing mice

        4 討論

        通過對活性先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾發(fā)現(xiàn)新的活性成分是創(chuàng)制新藥的有效途徑之一[10]。本課題所采用的ADS003即是以九節(jié)龍皂苷為先導(dǎo)物,對其30位醛基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾所得的產(chǎn)物,前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該修飾物具有明顯的抗腫瘤活性。但其具體抗腫瘤分子機(jī)制還有待研究。

        本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ADS003對腦膠質(zhì)瘤U373的抑制作用。體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞經(jīng)ADS003處理后,隨著藥物濃度的增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖受抑制的作用越明顯;隨著藥物作用時間的延長,抑制作用增強(qiáng),呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。FCM實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADS003可劑量依賴性的促進(jìn)U373細(xì)胞凋亡,免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ADS003誘發(fā)U373細(xì)胞凋亡與其促進(jìn)凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表達(dá)有關(guān)。通過對裸鼠移植性實(shí)體瘤模型研究發(fā)現(xiàn),ADS003能抑制腫瘤生長,免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)ADS003給藥后,上調(diào)了Caspase3、p-Caspase3的表達(dá)。

        腫瘤的發(fā)生是多因素相互作用、極其復(fù)雜的過程,而藥用植物中的活性成分可通過多種途徑、多個靶點(diǎn)發(fā)揮其生物學(xué)作用,成為目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[11]。ADS003是九節(jié)龍皂苷的修飾物,本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)外兩方面證實(shí)了其抑瘤機(jī)理,ADS003能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長,呈劑量依賴性;并能夠誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,這種作用機(jī)制極可能是通過上調(diào)促進(jìn)凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3,誘發(fā)U373細(xì)胞大量凋亡,發(fā)揮重要的抗腫瘤作用。綜上所述,上述研究結(jié)果為該藥進(jìn)一步的研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和立論依據(jù)。

        [1]Sparg S G,Light M E,van Staden J.Biological activities and distribution of plant saponins[J].J Ethnopharmacol,2004,94(2-3):219-243.

        [2]粱克明,王四旺,王曉娟.九節(jié)龍皂甙對8株人癌細(xì)胞的抑制作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2001,22(7):671-672.

        [3]梁克明,謝艷華,王曉娟,等.九節(jié)龍皂甙對Hela細(xì)胞生長的抑制作用 [J].第三軍醫(yī)大學(xué),2002,24(6):725-728.

        [4]Xiong Jian,Cheng Guang,Tang Haifeng,et al.Ardipusilloside I induces apoptosis in human glioblastoma cells through a caspase-8-independent FasL/Fas-signaling pathway[J].Environ Toxicol Pharmacol,2009,27(2):264-270.

        [5]Lin Hong,Zhang Xiang,Cheng Guang,et al.Apoptosis induced by ardipusillosideⅢthrough BAD dephosphorylation and cleavage in human glioblastoma U251MG cells[J].Apoptosis,2008,13(2):247-257.

        [6]玉 石,李 娟,張曉楠.九節(jié)龍皂苷誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,9(14):2616-2644.

        [7]李 娟,張 磊,費(fèi) 舟,等.九節(jié)龍皂苷誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J].臨床神經(jīng)外科雜志,2009,5(2):57-60.

        [8]林 洪,章 翔,程 光,等.九節(jié)龍-Ⅲ 經(jīng)BAD凋亡途徑誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜,2008,7(5):431-435.

        [9]朱坤杰,宋 娟,沈云虹等.庫拉索蘆薈多糖和木立蘆薈多糖體內(nèi)抗腫瘤作用[J].中成藥,2010,11(32):1978-1980.

        [10]晏仁義,陳若蕓.天然產(chǎn)物中先導(dǎo)化合物的優(yōu)化與發(fā)現(xiàn)[J].中國天然產(chǎn)物,2005,3(6):332-335.

        [11]陳 穎,周 巖,曹銀萍.中藥皂苷類化合物體外抗腫瘤研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥藥學(xué)雜志,2011,31(7):591-592.

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