周競奇,李維山
(1.濟(jì)源市人民醫(yī)院,河南濟(jì)源454650;2.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,河南 漯河462000)
結(jié)腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)病率有上升的趨勢,患者的預(yù)后與結(jié)腸癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的過度表達(dá)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。本實(shí)驗(yàn)利用組織芯片技術(shù),在一張玻片上一次性完成本研究所采集的組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)標(biāo)記,檢測59例結(jié)腸腺癌組織中MMP-2的表達(dá),探討其在結(jié)腸腺癌組織中的表達(dá)情況及與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。
1.1 標(biāo)本來源 選自濟(jì)源市人民醫(yī)院和濟(jì)源市第二人民醫(yī)院病理科2006年至2010年存檔材料。59例結(jié)腸腺癌患者均經(jīng)復(fù)查和病理確診?;颊吣挲g35~65歲,平均年齡45歲。其中高分化16例,中分化25例,低分化18例;并選取正常結(jié)腸組織10例作為對照。標(biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定,石蠟包埋。
1.2 主要試劑 單克隆抗體MMP-2購自福州邁新公司,S-P二步法試劑盒和DAB顯色劑購自北京中杉生物公司。
1.3 組織芯片的手工制作 用手電鉆在空白蠟塊上構(gòu)建10×9個點(diǎn)陣,間距2 mm。用空心針(內(nèi)徑1.8 mm)把目標(biāo)組織穿刺取下圓柱狀標(biāo)本,分別種植到對應(yīng)的點(diǎn)陣中,在38℃恒溫箱中烘烤2 h,與空白蠟塊融合為一體。
1.4 免疫組織化學(xué) 采用S-P二步法,嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)檢測試劑盒說明書指導(dǎo)步驟進(jìn)行染色:將構(gòu)建的芯片蠟塊以5 μm厚連續(xù)切片,常規(guī)脫臘至水,體積分?jǐn)?shù)3%H2O215 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性,置入有 0.01 mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)的高壓鍋內(nèi)加熱進(jìn)行抗原修復(fù)(從高壓鍋開始慢慢噴氣時,計時3 min),迅速冷卻后洗滌。滴加一抗MMP-2(1∶100),濕盒中孵育,4℃冰箱中過夜,PBS充分洗滌,DAB顯色。蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化,脫水、透明、水溶性樹脂封片,光鏡下觀察。
1.5 陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) MMP-2陽性信號以細(xì)胞漿出現(xiàn)淡黃色至棕黃色為陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞占全部腫瘤細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞的百分比及著色程度判斷結(jié)果:無明顯陽性反應(yīng)細(xì)胞或陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性;有著色較強(qiáng)細(xì)胞或陽性細(xì)胞數(shù)>10%為陽性[2]。采用雙盲法,由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生分別對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評估。
1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,率的比較采用χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2.1 MMP-2在結(jié)腸腺癌組織和正常結(jié)腸組織中的表達(dá) MMP-2在59例結(jié)腸腺癌組織中的表達(dá)率為62.7%(37/59),高于正常結(jié)腸組織中表達(dá)率20.0%(2/10),差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。陽性信號主要定位于細(xì)胞質(zhì)。見表1,圖1、2。
表1 MMP-2蛋白在不同結(jié)腸組織中的表達(dá) 例
2.2 MMP-2在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 MMP-2在結(jié)腸中的陽性率和腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度以及分化程度有關(guān)(P<0.05),而與患者的年齡無關(guān)(P>0.05)。見表2。
表2 MMP-2的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例
近年來的研究[3]表明腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移最重要的一步就是通過基底膜和細(xì)胞外基質(zhì),而腫瘤細(xì)胞可以分泌MMP-2,最終MMP-2被激活形成Ⅳ型膠原蛋白酶,降解和破壞腫瘤細(xì)胞周圍細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白及明膠,從而得以沿著破壞的基膜向周圍組織浸潤蔓延,浸潤血管、淋巴管或者體腔后即可發(fā)生轉(zhuǎn)移。Papadopoulou等[4]的研究表明 MMP-2的高表達(dá)和結(jié)腸腫瘤的大小,臨床分期以及組織學(xué)分級有關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。但是也有研究[5]表明MMP-2的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。本文結(jié)果表明,MMP-2在結(jié)腸腺癌組織中表達(dá)陽性率高于正常結(jié)腸組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其陽性表達(dá)率與患者組織分化程度,腫瘤大小,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度均有關(guān),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與患者的年齡無關(guān)(P>0.05),這與文獻(xiàn)[4]報道基本一致。MMP-2 表達(dá)率越高,腫瘤體積越大,分化越差,浸潤越深,越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,說明MMP-2不僅參與結(jié)腸腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移,而且參與了結(jié)腸腺癌的發(fā)生。因此臨床中檢測腫瘤組織中MMP-2的表達(dá)可能會成為判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。
[1]Arvelo F,Cotte C.Metalloproteinases in tumor progression.Review[J].Invest Clin,2006,47(2):185 -205.
[2]郭琦,唐芙愛,李印,等.Claudin-1和VEGF-c在食管鱗癌中的表達(dá)[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2009,18(6):515 -517.
[3]Patel BP,Shah SV,Shukla SN,et al.Clinical significance of MMP-2 and MMP-9 in patients with oral cancer[J].Head Neck,2007,29(6):564-572.
[4]Papadopoulou S,Scorilas A,Arnogianaki N,et al.Expression of gelatinase-A(MMP-2)in human colon cancer and normal colon mucosa[J].Tumour Biol,2001,22(6):383 -389.
[5]蔡鳳林,周士福,馬兆生,等.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中 COX-2、MMP-2的表達(dá)及其相關(guān)性[J].實(shí)用癌癥雜志,2008,23(1):44-47.