李世朋，王朏朏，丁雪貞，李文雅，于 樂，宋 瑩，席守民，2

(1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽471003;2.河南科技大學(xué)藥理學(xué)與醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽471003)

腎透明細(xì)胞癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其癌細(xì)胞通過直接蔓延、淋巴轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移及種植轉(zhuǎn)移等多種方式在體內(nèi)播散，從而影響疾病的預(yù)后。水通道蛋白－1(aquaporin-1，AQP-1)是對(duì)水專一的通道蛋白，其所介導(dǎo)的自由水快速被動(dòng)地跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)是水進(jìn)出細(xì)胞的主要途徑。現(xiàn)已明確AQP-1是腎臟重吸收水、濃縮尿液，從而維持機(jī)體水平衡的主要分子基礎(chǔ)。研究表明，AQP-1在多種腫瘤組織、微血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，其與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系［1］。作者采用免疫組化法檢測(cè)人腎透明細(xì)胞癌組織中AQP-1的表達(dá)，旨在探討AQP-1與腎腫瘤的生成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2006年2月至2011年7月接受腎透明細(xì)胞癌手術(shù)治療患者術(shù)后存檔的石蠟標(biāo)本25例，其中男性16例，女性9例;年齡36～73歲。所有患者均經(jīng)常規(guī)病理診斷確診，術(shù)前均未接受化療、放療或免疫治療。隨機(jī)選取20例正常腎臟組織存檔石蠟標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男性13例，女性7例;年齡34～68歲。所有病例均有完整的臨床資料。

1.2 主要試劑 AQP-1兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶200)購自武漢博士德生物工程有限公司 ;DAB顯色試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;免疫組化試劑盒(美國ZYMED公司產(chǎn)品)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 方法 每例蠟塊4 μm厚連續(xù)切片5張，其中1張進(jìn)行HE染色，另4張進(jìn)行免疫組化染色。采用免疫組化S-P二步法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，蒸餾水沖洗，0.01 mol·L－1枸櫞酸緩沖液微波抗原修復(fù)15 min后自然冷卻至室溫，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗2 min×3次;加封閉血清，滴加一抗，4℃過夜，PBS沖洗2 min×3次;滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min;PBS沖洗5 min×3次;DAB顯色，顯微鏡下控制，自來水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 選用試劑盒中的陽性片作為陽性對(duì)照，PBS取代一抗作為陰性對(duì)照。AQP-1可以表達(dá)于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，染色呈棕黃色視為陽性。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，采用半定量積分法依據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率判斷染色結(jié)果。按染色強(qiáng)度評(píng)分，無著色:0分，淺黃色:1分，棕黃色:2分，棕褐色:3分;按陽性細(xì)胞百分率評(píng)分，無陽性細(xì)胞:0分，＜25%:1分，25%～50%:2分，50% ～75%:3分，＞75%:4分。2項(xiàng)評(píng)分之和:0分(－)，1～2分(+)，3～4分(++)，5～7分(+++)。結(jié)果判定采用雙盲法，由2名有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)生確定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

AQP-1染色主要存在于細(xì)胞膜，細(xì)胞漿亦有部分染色。在正常腎組織近曲小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中可見大量棕黃色染色，在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上可見少量棕黃色染色，在腎透明細(xì)胞癌的癌細(xì)胞中僅見少量的細(xì)胞膜著色，而毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中可見細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)著色。與正常腎組織相比，腎透明細(xì)胞癌組織中AQP-1陽性表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而在腎透明細(xì)胞癌組織中毛細(xì)血管增生，毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP-1陽性表達(dá)明顯較正常腎臟組織增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖 1，表 1、2。

表1 AQP-1在不同腎臟組織腎小管中的表達(dá)

表2 AQP-1在不同腎組織毛細(xì)血管中的表達(dá)

3 討論

在腎臟組織中，AQP-1在近曲小管、髓袢降支段的內(nèi)皮細(xì)胞都有表達(dá)，AQP-1參與了尿液的濃縮并在逆流交換機(jī)制上起著重要作用。AQP-1分布廣泛，不僅存在于分泌及吸收型上皮細(xì)胞中，而在毛細(xì)血管及小血管內(nèi)皮細(xì)胞中也很豐富［2］。存在于淋巴管、毛細(xì)血管和小靜脈內(nèi)皮中的AQP-1，對(duì)于水分迅速進(jìn)入淋巴管和血管床，調(diào)控細(xì)胞間滲透壓和血管內(nèi)的流體靜壓與膠體滲透壓起著平衡的作用。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成，為了保持腫瘤細(xì)胞無限制的侵襲性生長，腫瘤組織必須依賴持續(xù)的、廣泛的新生血管形成。目前研究證明，AQP-1在血管新生和腫瘤細(xì)胞遷移中發(fā)揮著重要的作用［3－6］。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞增殖快，新陳代謝異常活躍，對(duì)水的需求也增加，因此水通道蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的生存非常重要。AQP-1可在多種腫瘤組織、細(xì)胞系及腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，Mobasheri等［7］認(rèn)為AQP-1在疾病狀態(tài)下改變了新生血管的形成，由此促進(jìn)了腫瘤組織血管的異常表現(xiàn)，而腫瘤組織血管的生成在其生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中起重要作用。

本文應(yīng)用免疫組化法對(duì)AQP-1在腎透明細(xì)胞癌組織和正常腎臟組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，AQP-1在正常腎臟近曲小管上皮細(xì)胞呈陽性表達(dá)，而在腎透明細(xì)胞癌組織中近曲小管遭到破壞，AQP-1表達(dá)明顯減少。AQP-1在兩種組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但腎透明細(xì)胞癌組織中毛細(xì)血管增生，且毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP-1表達(dá)增多且呈強(qiáng)陽性，同正常腎臟組織的表達(dá)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。推測(cè)AQP-1參與了腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜水和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控，促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，參與了腎透明細(xì)胞癌浸潤與轉(zhuǎn)移。AQP-1參與了腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移，并在此過程中起促進(jìn)作用。

目前對(duì)于AQP-1參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的研究已有報(bào)道，但對(duì)AQP-1在腎透明細(xì)胞癌中的研究少見，還有許多問題尚未闡明，需進(jìn)一步的深入研究。

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