徐鋼春，魏廣蓮，李建林，徐跑，張呈祥，顧若波

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫214081;3.江陰市水產(chǎn)指導(dǎo)站，江蘇江陰214431)

刀鱭Coilia nasus隸屬于鯡形目、鳀科、鱭屬，俗稱刀魚，為中國長(zhǎng)江重要的經(jīng)濟(jì)洄游性魚類［1-2］，其脂肪豐滿、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，享有“長(zhǎng)江三鮮”之一的美譽(yù);但近年來刀鱭天然資源量急劇減少，種質(zhì)小型化明顯，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求［3-4］。隨著刀鱭灌江納苗［5］、幼魚采捕［6］的成功實(shí)施后，人工繁殖試驗(yàn)也取得了成功［7］，刀鱭的池塘養(yǎng)殖正逐漸成為新興的產(chǎn)業(yè)。程起群等［8］以線粒體細(xì)胞色素b基因片段序列為分子標(biāo)記，分析了長(zhǎng)江野生刀鱭和湖鱭Coilia nasus taihuensis的遺傳關(guān)系，認(rèn)為湖鱭是刀鱭的一個(gè)地理種群且遺傳多樣性水平增加，同時(shí)還認(rèn)為，隔離和適應(yīng)是形態(tài)差異形成的重要因素［9］。隨著刀鱭人工養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，很有必要對(duì)刀鱭淡水養(yǎng)殖群體和湖鱭的遺傳多樣性和遺傳分化狀況進(jìn)行深入研究，從而促進(jìn)刀鱭人工養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。

在mtDNA上，D-loop區(qū)的進(jìn)化速度最快，用它來進(jìn)行種內(nèi)、種群間的系統(tǒng)進(jìn)化分析，是一種在分子水平上研究魚類種群遺傳多樣性比較經(jīng)濟(jì)有效的手段［10-14］。本研究中，作者以灌江納苗后完全在淡水池塘環(huán)境中繁育、養(yǎng)殖的刀鱭群體與湖泊定居的湖鱭為試驗(yàn)材料，運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)D-loop區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，旨在從分子水平上分析其遺傳多樣性及相互間的差異水平，為保護(hù)刀鱭種質(zhì)資源和有效地開展刀鱭遺傳育種研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用養(yǎng)殖刀鱭11尾，為2004年灌江納苗養(yǎng)殖并繁育的子三代，于2010年8月采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江三鮮養(yǎng)殖與示范基地，體質(zhì)量為17.7～85.5 g，平均為36.2 g;湖鱭8尾，于2010年9月采自太湖梅梁灣段，體質(zhì)量為25.7～40.4 g，平均為33.5 g。從每尾魚剪取少許背部肌肉分別放入Eppendorf管中，于-20℃下保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將肌肉剪碎，分別放入1.5 mL Eppendorf管中，加入470 μL SET緩沖液，再依次加入12.5 μL 20% 的 SDS 和 10 μL(10 mg/mL)蛋白酶K，混合后在55℃水浴中消化過夜，再分別用飽和酚、酚氯仿、氯仿/異戊醇抽提去除蛋白，最后用預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA，烘干后用TE溶解。所得基因組DNA樣品用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品的濃度和純度，同時(shí)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性并估測(cè)分子量。將DNA原樣稀釋至50 ng/μL，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 使用兩個(gè)通用引物DF1和DR2擴(kuò)增D-loop區(qū)段基因，引物序列DF1:5'-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3'，DR2:5'-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3'［15］。擴(kuò)增反應(yīng)混合物總體積25 μL，包括 DNA 模板 1.5 μL，10×Reaction buffer 2.5 μL，200 μmol/L dNTP 0.5 μL，引物(濃度 0.2 μmol/L)各 1 μL，Taq 酶 (1 U)0.2 μL，用無菌ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃下預(yù)變性3 min;94℃下變性30 s，50℃下退火1 min，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后在72℃下再延伸8 min。PCR產(chǎn)物用14 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并拍照記錄。目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物用試劑盒回收純化后，由上海博尚生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，本研究中，除用引物DF1和DR2由兩端向中部測(cè)序外，還根據(jù)所得的序列再設(shè)計(jì)一對(duì)引物 (F:5'-GCGGATTCTCCGTAGACAAC-3'，R:5'-GTAAAATTGTCTGGGTCTCC-3')由序列中部向兩端進(jìn)行測(cè)序，以增加測(cè)序的準(zhǔn)確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

序列用Clustal W 1.83軟件［16］分析比對(duì)。利用DnaSP 4.0軟件［17］統(tǒng)計(jì)單倍型及變異位點(diǎn)(S)、計(jì)算單倍型多樣性 (H)、核苷酸多樣性 (π)及平均核苷酸差異數(shù) (K)。用Mega 3.0軟件［18］中的Kimura雙參數(shù)法計(jì)算各單倍型間的遺傳距離。采用NJ法 (Neighbor-joining)對(duì)基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Bootstrap置信值估算重復(fù)次數(shù)為1 000次。

2 結(jié)果

2.1 線粒體D-loop區(qū)段基因擴(kuò)增結(jié)果

養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭的D-loop區(qū)段基因均能被清晰穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳圖譜見圖1。從圖1可見，D-loop區(qū)段基因長(zhǎng)度為1 200 bp左右。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后測(cè)序，測(cè)出的序列參照GenBank中已有的刀鱭D-loop區(qū)段序列 (登錄號(hào)為NC_009579)，經(jīng)Clastal X比對(duì)分析，結(jié)果表明同源性都高達(dá)99%以上，確定所得序列為刀鱭mtDNA D-loop區(qū)序列。

養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭兩個(gè)群體D-loop區(qū)段基因片段中，A、T、G、C堿基含量分別為 33.3%、33.3%、14.2%、19.2%。其中，A+T堿基含量(66.6%)高于C+G的含量 (33.4%)。

圖1 養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭mtDNA D-loop區(qū)段PCR電泳圖Fig.1 The PCR eletrophoretogram of mtDNA D-loop in the populations of farmed Coilia nasus and Coilia nasus taihuensis

2.2 遺傳多樣性分析

通過序列分析，養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭的D-loop序列全長(zhǎng)都有較大的變異，養(yǎng)殖刀鱭的D-loop序列長(zhǎng)度為1 210～1 252 bp，若以刀鱭 (NC_009579)D-loop序列全長(zhǎng)1 252 bp為標(biāo)準(zhǔn)，則11尾養(yǎng)殖刀鱭中，只有2尾魚序列長(zhǎng)度沒有變化，其他9個(gè)個(gè)體存在1、3、38 bp 3種片段的缺失;湖鱭的D-loop序列長(zhǎng)度為1 252～1 290 bp，8尾湖鱭中有3個(gè)個(gè)體存在38 bp片段的插入。

在兩個(gè)群體19尾個(gè)體中，共檢測(cè)到變異位點(diǎn)(S)35個(gè)，占全部序列的2.79%，其中單一多態(tài)位點(diǎn)14個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)21個(gè)。繪制堿基變異位點(diǎn)分布圖如圖2所示。由圖2可以看出，除了堿基在100以內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)外，其他多態(tài)位點(diǎn)十分一致，這與D-loop區(qū)段基因具有一定的保守性和穩(wěn)定性相符合。本研究中共檢測(cè)到12種不同的單倍型，單倍型多態(tài)性 (H)為0.924;核苷酸多樣性(π)為0.0099，平均核苷酸差異數(shù) (K)為4.154;遺傳距離為0～0.020，平均遺傳距離為0.015;養(yǎng)殖刀鱭、湖鱭與七絲鱭 (EF_419803)的平均遺傳距離分別為0.0528、0.0537，而養(yǎng)殖刀鱭與湖鱭的平均遺傳距離為0.0148，明顯小于它們與七絲鱭的平均遺傳距離。養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭群體內(nèi)的各遺傳多樣性參數(shù)如表1所示。由表1可以看出，養(yǎng)殖刀鱭的各遺傳多樣性參數(shù)稍高于湖鱭，說明養(yǎng)殖刀鱭比湖鱭的遺傳多樣性要豐富。

2.3 分子系統(tǒng)樹

以七絲鱭(EF_419803)和刀鱭的D-loop區(qū)段序列(NC_009579)為參考進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示，整個(gè)群體聚類成兩大支，七絲鱭為一大支，養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭聚在一起組成另一大分支。在養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭聚在一起組成的分支中，養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭又各自聚在一起，形成獨(dú)立的單系類群(圖3)。

圖2 刀鱭兩個(gè)群體多態(tài)位點(diǎn)序列分布圖Fig.2 The base sequence of polymorphic fragments between this two populations

表1 養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭兩個(gè)群體的遺傳多樣性Tab.1 Populational genetic diversity in farmed Coilia nasus and Coilia nasus taihuensis

圖3 基于D-loop區(qū)段序列構(gòu)建的幾種鱭屬魚類的鄰接樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree in several anchovy species based on the D-loop sequences construced by NJ method

3 討論

3.1 刀鱭和湖鱭種群控制區(qū)序列的堿基組成

所測(cè)定的19尾刀鱭mtDNA D-loop區(qū)序列中，堿基 A、T、G、C的平均含量分別為 33.3%、33.3%、14.2%、19.2%，從堿基組成可以看出，D-loop區(qū)段表現(xiàn)出很強(qiáng)的堿基組成偏向性，即在A、T、G、C 4種堿基中，G的含量明顯低于其他3種堿基的含量;此外，刀鱭mtDNA D-loop區(qū)中A+T堿基的含量 (66.6%)高于G+C堿基(33.4%)，符合脊椎動(dòng)物mtDNA D-loop區(qū)堿基組成的特點(diǎn)［19］，并與劉煥章［20］、韓虎峰等［21］關(guān)于魚類mtDNA控制區(qū)的研究結(jié)果一致，同時(shí)與鱭屬其他種類一樣［22］，具有高比例的 A+T可能是mtDNA D-loop序列變異較快的原因之一。

3.2 遺傳變異及遺傳多樣性

本試驗(yàn)中測(cè)定的養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭兩個(gè)群體的D-loop序列中共檢測(cè)出35個(gè)變異位點(diǎn)，占全部序列的2.79%，共定義了12個(gè)單倍型，顯示出較為豐富的遺傳多樣性，與程起群等［8］、葛家春等［23］和馬春艷等［24］的研究結(jié)果一致。

人工養(yǎng)殖環(huán)境中因基礎(chǔ)群體數(shù)量過小、養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的近交衰退等因素可能導(dǎo)致養(yǎng)殖群體遺傳多樣性降低，進(jìn)而影響?zhàn)B殖魚類的經(jīng)濟(jì)性狀，最終對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成較大的危害［25-26］。本試驗(yàn)中養(yǎng)殖刀鱭各遺傳多樣性參數(shù)稍高于湖鱭，說明養(yǎng)殖刀鱭的遺傳多樣性比湖鱭更為豐富，這點(diǎn)從養(yǎng)殖刀鱭D-loop序列長(zhǎng)度存在比湖鱭更多樣的變化也能得到印證。湖鱭是長(zhǎng)時(shí)期陸封型刀鱭群體［8］，由于奠基者效應(yīng) (Founder effect)等因素的影響，湖鱭的遺傳多樣性水平可能會(huì)較低。養(yǎng)殖刀鱭雖然沒有和外界群體發(fā)生基因交流，但可能由于其親本是由灌江納苗而培育繁殖的子三代，其有著較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力，仍還保持著較高的遺傳多樣性。然而，在經(jīng)過數(shù)代或者更長(zhǎng)時(shí)間的人工繁育后，刀鱭種群的遺傳多樣性水平仍然可能因受到影響而出現(xiàn)衰退的現(xiàn)象。此外，本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭兩個(gè)群體的個(gè)體間D-loop序列長(zhǎng)度的多態(tài)性，序列長(zhǎng)度差異主要源于以38 bp為基本單位的不同次數(shù)的片段重復(fù)，唐文喬等［15］的研究也出現(xiàn)過相似的結(jié)果。有學(xué)者認(rèn)為，這是由于某些魚類增加遺傳變異的一種方式，對(duì)維持物種的生存有一定的作用［27］。

Billington等［28］報(bào)道魚類種內(nèi)遺傳距離一般在10%以內(nèi)，對(duì)其他一些動(dòng)物的D-loop區(qū)段基因系列分析表明，種內(nèi)個(gè)體間的序列差異一般在0～4.06%，差異超過6%的個(gè)體間已有明顯的亞種或者種的分化［29］，而本試驗(yàn)中養(yǎng)殖刀鱭、湖鱭與七絲鱭的差異分別為5.28%和5.37%，超出了一般種內(nèi)個(gè)體間的序列差異范圍，但養(yǎng)殖刀鱭與湖鱭的平均遺傳距離為1.48%，仍屬于種內(nèi)個(gè)體間的序列差異，未達(dá)到種或亞種的分化，這與唐文喬等［15］的研究結(jié)果相似。雖然系統(tǒng)樹中養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭各自聚在一起，形成獨(dú)立的單系類群，但養(yǎng)殖刀鱭和湖鱭共同構(gòu)成1個(gè)單系群，說明它們?yōu)閮煞N生態(tài)型種群，并非兩種有效物種，這與程起群等［8］的研究結(jié)果一致。

當(dāng)然，由于野生刀鱭資源量急劇減少使得人工繁育、養(yǎng)殖、放流成為一種新的保護(hù)刀鱭資源的有效方法，所以，應(yīng)該保持一定數(shù)量的人工繁育刀鱭親本，使其適時(shí)與洄游刀鱭進(jìn)行基因交流，以保障養(yǎng)殖刀鱭較高的遺傳多樣性，同時(shí)防止養(yǎng)殖群體出現(xiàn)種質(zhì)退化等現(xiàn)象，科學(xué)地保護(hù)刀鱭種質(zhì)資源，達(dá)到資源的可持續(xù)利用。

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