康健捷 劉 雁 徐海偉 (廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 5000)

索曼(O-1，2，2-trime thylpropy1 methylphosphonofluoridate)屬有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物，與對(duì)硫磷、乙拌磷等農(nóng)用殺蟲(chóng)劑有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)期接觸小劑量有機(jī)磷化合物可導(dǎo)致人學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能下降，索曼揮發(fā)度適中，易于分散，可通過(guò)皮膚和呼吸道雙途徑吸收引起全身中毒〔1〕。作為強(qiáng)烈的膽堿酯酶(AChE)抑制劑，大劑量急性染毒時(shí)，索曼通過(guò)迅速不可逆地抑制神經(jīng)突觸中的AChE引起乙酰膽堿(Ach)大量堆積，從而導(dǎo)致中樞和外周膽堿能神經(jīng)過(guò)度刺激而產(chǎn)生臨床癥狀〔2，3〕。慢性小劑量索曼染毒可在無(wú)明顯軀體膽堿能過(guò)度刺激癥狀的情況下導(dǎo)致腦損害，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降〔4〕，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，突觸后膜Ach受體m1在學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能和海馬及皮層的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)過(guò)程中起重要作用〔5〕，神經(jīng)末梢的突觸前膜Ach受體m4對(duì)Ach的釋放進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法，觀察小劑量索曼染毒對(duì)大鼠海馬及前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型建立 雄性健康Wistar大鼠，24只，體質(zhì)量(180±30)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所提供。隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、半數(shù)致死量對(duì)照組、6 μg/kg染毒組和10 μg/kg染毒組，每組 6 只。6 μg/kg染毒組和 10 μg/kg染毒組每天上午背部皮下注射一次索曼，劑量分別分6 μg/kg(相當(dāng)于 0.06 LD50)和 10 μg/kg(相當(dāng)于 0.1 LD50)，共 14 d。生理鹽水對(duì)照組每天注射相同體積的生理鹽水。末次給藥后第2天，取大鼠腦組織用于檢測(cè)Ach受體m1和m4 mRNA表達(dá)水平;半數(shù)致死量對(duì)照組大鼠取樣前注射一次索曼，劑量分100 μg/kg(相當(dāng)于 LD50)。

1.2 RT-PCR檢測(cè)小劑量索曼染毒對(duì)大鼠腦組織Ach受體m1和m4 mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)所需試劑及器材預(yù)先經(jīng)過(guò)焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理。末次給藥第2天上午將大鼠斷頭處死，于冰臺(tái)上分離出海馬和前額葉皮層各10 mg，取同組6例共60 mg，加入1 ml Tripure，用玻璃勻漿器充分勻漿;提取總RNA、檢測(cè)RNA濃度和純度、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)、多聚酶鏈反應(yīng)。引物設(shè)計(jì):從 GenBenk(http://www.ncbi.nih.gov/entrez/nucleoyide.htlm)中調(diào)取大鼠Ach受體m1、m4和甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)完整 cDNA序列，以此為參照，通過(guò)網(wǎng)站(www.genome.wi.mit.edu)提供的引物設(shè)計(jì)程序，設(shè)計(jì)出PCR引物序列。通過(guò)同源性比較(http://www.ncbi.nih.gov/blast)均為特異引物，送上海Bioasia公司合成。根據(jù)擴(kuò)增條帶的位置和熒光強(qiáng)度，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物大小。將處理組與對(duì)照組比較，觀察熒光強(qiáng)度的OD值，增強(qiáng)為表達(dá)上調(diào)，反之為下調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差檢驗(yàn)，計(jì)量資料均以±s表示。

2 結(jié)果

在14 d給藥期間生理鹽水對(duì)照組、6 μg/kg染毒組、10 μg/kg染毒組大鼠均未發(fā)現(xiàn)有驚厥、死亡現(xiàn)象，10 μg/kg染毒組有輕微腹瀉現(xiàn)象。半數(shù)致死量對(duì)照組(100 μg/kg)大鼠均出現(xiàn)驚厥，其中2只死亡。

半數(shù)致死量對(duì)照組(100 μg/kg組)大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA表達(dá)均與生理鹽水對(duì)照組無(wú)顯著差別。小劑量染毒組(6 μg/kg組和10 μg/kg組)大鼠前額葉皮層Ach受體m1 mRNA表達(dá)均顯著低于生理鹽水對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);海馬Ach受體m1 mRNA表達(dá)略低于生理鹽水對(duì)照組，但組間無(wú)差異(P＞0.05)，前額葉皮層和海馬Ach受體m4 mRNA表達(dá)均顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P＜0.05)，其中10 μg/kg組大鼠前額葉皮層 Ach受體 m4 mRNA表達(dá)與生理鹽水對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)。在生理鹽水對(duì)照組和半數(shù)致死量對(duì)照組間Ach受體m1 mRNA和m4 mRNA均無(wú)顯著差別(P＞0.05)。見(jiàn)表1，圖1，圖2。

表1 索曼染毒大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA的變化(OD乙酰膽堿受體m1(乙酰膽堿受體m4)/ODGAPDH)(±s)

表1 索曼染毒大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m1和m4 mRNA的變化(OD乙酰膽堿受體m1(乙酰膽堿受體m4)/ODGAPDH)(±s)

與生理鹽水對(duì)照組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01，與半數(shù)致死量對(duì)照組比較:3)P＜0.05

±0.046組別 n 乙酰膽堿受體m1海馬 前額葉皮層乙酰膽堿受體m4海馬±0.025 6 μg/kg染毒組 6 0.275±0.022 0.250±0.0161)3) 0.627±0.0301)3) 0.364±0.0311)3)10 μg/kg染毒組 6 0.270±0.019 0.247±0.0181)3) 0.671±0.0741) 0.426±0.0662)半數(shù)致死量對(duì)照組 4 0.289±0.029 0.277±0.028 0.531±0.054 0.271前額葉皮層生理鹽水對(duì)照組 6 0.294±0.027 0.287±0.021 0.528±0.031 0.274

圖1 各組大鼠海馬(左圖)和前額葉皮層(右圖)Ach受體m1 mRNA的表達(dá)(上:m1，下:GAPDH)

圖2 各組大鼠海馬(左圖)和前額葉皮層(右圖)Ach受體m4 mRNA的表達(dá)(上:m4，下:GAPDH)

3 討論

親酯性索曼可迅速穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，在體內(nèi)的水解非常緩慢，特別是在腦和肌肉中〔6〕。索曼持續(xù)不可逆地抑制AchE，并使之老化，導(dǎo)致Ach降解減弱，造成腦組織Ach大量堆積。既往的研究采用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示慢性小劑量索曼染毒可抑制大鼠學(xué)習(xí)記憶的獲得與鞏固過(guò)程，降低已儲(chǔ)存記憶的讀出或提取能力〔4〕?，F(xiàn)有理論認(rèn)為:腦內(nèi)膽堿能受體的增減受Ach含量的調(diào)控，Ach含量高則膽堿能受體數(shù)量下降，反之則升高。AchE能迅速催化Ach的水解，是Ach水解的主要方式，AchE活性的變化可直接反映Ach的代謝情況，從而在一定程度上體現(xiàn)膽堿能系統(tǒng)的功能狀況。因此，研究有機(jī)磷中毒對(duì)膽堿能系統(tǒng)的影響時(shí)，常選用測(cè)定AchE的活性來(lái)反映膽堿水平。以往的研究證實(shí):大鼠連續(xù)14 d皮下注射小劑量索曼，其海馬和前額葉皮層的AchE活性明顯下降，對(duì)Ach的降解作用減弱，造成與認(rèn)知記憶功能密切相關(guān)腦區(qū)Ach大量堆積〔4〕。

Ach受體M受體亞型m1和m4的mRNA和蛋白在海馬和額葉皮層均有較高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)觀察到慢性小劑量索曼染毒大鼠前額葉皮層Ach受體m1 mRNA表達(dá)與生理鹽水對(duì)照組相比明顯降低。推測(cè)大量堆積的Ach長(zhǎng)期過(guò)度刺激突觸后膜的Ach受體，導(dǎo)致Ach受體m1在基因水平轉(zhuǎn)錄減少，從而可能導(dǎo)致Ach受體蛋白水平下降。而膽堿能系統(tǒng)與認(rèn)知記憶功能密切相關(guān)，尤其是海馬和前額葉皮層，研究證實(shí)突觸后膜Ach受體m1下降，膽堿能系統(tǒng)功能下降，可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，并抑制海馬及皮層的LTP〔7〕。以往的研究顯示慢性小劑量索曼染毒可降低海馬LTP誘出率，降低群峰電位(PS)增加幅值〔8〕，提示索曼可降低海馬突觸可塑性。因此，索曼可能從基因水平下調(diào)Ach受體m1，降低海馬突觸可塑性和膽堿能系統(tǒng)功能，從而導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Ach受體m4在突觸前膜，當(dāng)突觸間隙Ach增高時(shí)，m4受體則上調(diào)，以減少Ach的釋放。所以，突觸前膜Ach受體m4對(duì)Ach釋放起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。既往研究表明Ach受體m4上調(diào)與學(xué)習(xí)記憶障礙有密切關(guān)系〔5〕。本研究結(jié)果顯示:兩組小劑量染毒大鼠海馬和前額葉皮層Ach受體m4 mRNA表達(dá)均明顯增加，且在AchE抑制率和Ach受體m4 mRNA表達(dá)增加程度上表現(xiàn)一致，即較大劑量的索曼較高程度地抑制AchE活力，導(dǎo)致Ach受體m4亞型在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)加強(qiáng)程度更高。而半數(shù)致死量對(duì)照組大鼠Ach受體m4 mRNA表達(dá)均與生理鹽水對(duì)照組無(wú)顯著差別，提示小劑量染毒組大鼠腦組織Ach受體m4 mRNA表達(dá)增加是索曼慢性作用的結(jié)果，而Ach受體m4 mRNA表達(dá)增加必導(dǎo)致對(duì)Ach的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)，逐漸降低突觸前膜對(duì)Ach的釋放，從而導(dǎo)致神經(jīng)中樞膽堿能系統(tǒng)功能下降。

基于以上闡述，慢性小劑量索曼染毒可導(dǎo)致突觸后膜Ach受體m1從基因水平下調(diào)，而突觸前膜Ach受體m4從基因水平上調(diào)，以加強(qiáng)對(duì)Ach釋放的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致神經(jīng)中樞膽堿能系統(tǒng)功能下降，這可能是大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但有關(guān)索曼染毒致認(rèn)知功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究，還需要從與認(rèn)知功能有關(guān)的M受體亞型的蛋白水平及其他膽堿受體亞型基因水平等方面進(jìn)一步證實(shí)。

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