徐自強 張巖 楊亦榮 夏鵬 吳琦

慢性排斥反應(yīng)是目前影響移植物長期存活的主要原因。治療慢性移植物血管病是延緩慢性排斥反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展的有效策略之一［1］，也是當(dāng)前研究的熱點。雖然國內(nèi)外均進行了大量的研究，但對慢性排斥反應(yīng)及慢性移植物血管病的具體發(fā)病機制的認識沒有實質(zhì)性突破。其主要障礙之一是免疫、感染、炎癥、組織病理和生理等多種因素可以影響其病理發(fā)展［2］，而且這種病理變化現(xiàn)有的免疫抑制劑很難控制。最近的研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺有抗炎和抗血管生成的作用［3］，因此我們考慮其在治療慢性移植物血管病方面可能有一定的效果。本研究通過免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠移植血管組織上皮細胞增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和TNF-α，觀察沙利度胺對大鼠慢性移植物血管病的作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

近交系雄性 Brown-Norway(BN)大鼠，體質(zhì)量200～250 g，約8周齡;近交系雄性Lewis大鼠，約8周齡，體質(zhì)量200～250 g;均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司?？筆CNA、TNF-α抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 大鼠腹主動脈移植模型建立［4］

BN大鼠作為供體，腹腔內(nèi)注入1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，麻醉成功后取仰臥位，四肢固定，胸腹部脫毛，75%酒精、碘伏消毒，取腹部正中切口，暴露下腔靜脈和腹主動脈，鈍性分離腹主動脈和下腔靜脈，上至左腎動脈分支處，下至髂動脈分支處，結(jié)扎腹主動脈小分支及腰動脈。于腎動脈分支下、髂動脈分支上解剖、斷離腹主動脈1.0～1.5 cm，用肝素生理鹽水(100 mg/L)沖凈血管腔，修整血管外膜，并將其浸泡于保存液中置于4℃冰箱中保存。受體Lewis大鼠麻醉消毒后，取腹正中切口，暴露腹腔，借助顯微鏡剪開后腹膜，于腎動脈分支下、髂動脈分支上分離下腔靜脈和腹主動脈，無創(chuàng)血管夾夾閉后，離斷腹主動脈0.6～1.2 cm，用8-0血管縫合線將供鼠離體血管與受鼠腹主動脈端端縫合。

1.3 實驗分組

移植后32只Lewis大鼠采用隨機數(shù)字表法分為4組，每組各8只:同種移植對照組(Lewis-Lewis)、異種移植對照組(BN-Lewis)、沙利度胺小劑量組(BNLewis)、沙利度胺大劑量組(BN-Lewis)。其中同種和異種移植對照組兩組以生理鹽水2 mL灌胃60 d，沙利度胺小、大劑量兩組術(shù)前1 d起分別予以沙利度胺50 mg·kg-1·d-1及100 mg·kg-1·d-1灌胃 60 d。術(shù)后60 d處死受鼠，取出移植動脈，一部分留作光鏡標本用于組織病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)法檢測，另一部分速凍于液氮中用于蛋白質(zhì)印跡法檢測。

1.4 移植動脈組織病理學(xué)觀察

切取4組大鼠的移植動脈，以肝素生理鹽水(0.1 mg/mL)沖洗血管腔。標本用10%甲醛固定后石蠟包埋、切片，行HE染色。應(yīng)用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)(JD-801型，江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司)觀察移植動脈的病理變化情況，通過光學(xué)顯微鏡放大200倍攝取圖像，輸入圖像分析系統(tǒng)內(nèi)。每個標本在高倍視野下隨機取5個視野，測量移植動脈內(nèi)膜的厚度，取平均值。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測移植動脈組織PCNA、TNF-α表達

移植動脈經(jīng)多聚甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，3%過氧化氫室溫20 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，復(fù)合消化液室溫孵育10 min，兔血清封閉20 min。甩干后依次滴加抗鼠PCNA單克隆抗體(1∶200稀釋)、抗鼠TNF-α單克隆抗體(1∶200稀釋)，4℃過夜，陰性對照以PBS代替。生物素標記兔抗鼠IgG(1∶100稀釋，37℃孵育2 h)、辣根過氧化物酶標記鏈親和素(37℃孵育20 min)，每步驟之間均以PBS洗滌(5 min×3次)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后脫水封固鏡檢。每張切片在400倍光鏡下隨機采集5個不重疊視野，棕黃色為陽性染色區(qū)，采用圖像定量分析系統(tǒng)測量每個視野陽性染色區(qū)和光密度值，計算陽性相對面積(陽性染色區(qū)面積/每個視野面積)，取5個視野的平均值。陽性染色平均光密度=(陽性染色區(qū)面積/整個視野面積)×光密度值

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測移植動脈組織PCNA、TNF-α蛋白表達

取4組大鼠的移植腹主動脈，勻漿器充分研磨、勻漿，RIRA細胞裂解液裂解，在冰上放置30 min，于4℃、以離心半徑15 cm 12 000 r/min條件下離心15 min，棄沉淀，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度。30 μg蛋白上樣，12%SDS-PAGE電泳80 min，在4℃、250 mA電流條件下電轉(zhuǎn)1.5 h至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入 PCNA、TNF-α的一抗(1∶4000稀釋)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶100 000稀釋)，室溫孵育1.5 h，ECL試劑顯色并曝光成像，以β-肌動蛋白為內(nèi)參照。將膠片掃描后，采用Quantity OneV6.42軟件分析各條帶灰度值，將各目的條帶灰度值與同一標本內(nèi)參照β-肌動蛋白條帶灰度值的比值作為該目的蛋白的半定量結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，采用SPSS 11.5軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植動脈組織病理學(xué)表現(xiàn)

同種移植對照組移植動脈內(nèi)膜基本無增厚，內(nèi)膜細胞為單層，未見淋巴細胞浸潤，中膜和外膜無明顯改變(見圖1A)。異種移植對照組呈典型的移植物血管病表現(xiàn):可見內(nèi)膜環(huán)形增厚，大量成纖維細胞增生，內(nèi)膜內(nèi)可見少量淋巴細胞浸潤，中膜由4～6層彈力纖維和平滑肌構(gòu)成，內(nèi)彈力纖維有斷裂，在中膜與外膜之間有大量淋巴細胞浸潤，符合移植物血管病的病理改變(見圖1B)。沙利度胺小劑量組移植動脈輕度增生，呈內(nèi)膜炎表現(xiàn)，內(nèi)膜下可見淋巴細胞浸潤，在中膜與外膜之間可見少量淋巴細胞浸潤(見圖1C)。沙利度胺大劑量組移植動脈輕度增生，內(nèi)膜下可見少量淋巴細胞浸潤，在中膜與外膜之間可見少量淋巴細胞浸潤(見圖1D)。4組移植動脈內(nèi)膜厚度比較見表1。沙利度胺大劑量組血管內(nèi)膜厚度大于同種移植對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但沙利度胺大劑量組血管內(nèi)膜成纖維細胞較少，以炎癥細胞浸潤和內(nèi)皮細胞水腫為主。

注:A，同種移植對照組內(nèi)膜無增厚，為單層細胞;B，異種移植對照組內(nèi)膜明顯增厚，成纖維細胞增生;C，沙利度胺小劑量組內(nèi)膜輕度增生，呈內(nèi)膜炎表現(xiàn)，內(nèi)膜下可見淋巴細胞浸潤;D，沙利度胺大劑量組內(nèi)膜輕度增生，呈內(nèi)膜炎表現(xiàn)，內(nèi)膜下可見淋巴細胞浸潤

2.2 移植動脈組織PCNA和TNF-α定性表達

免疫組織化學(xué)法檢測移植動脈中PCNA和TNF-α的表達情況見表1和圖2，3。PCNA在同種移植對照組很少表達，在異種移植對照組內(nèi)皮細胞及新生內(nèi)膜中強陽性表達，在沙利度胺小劑量、大劑量組內(nèi)皮細胞及新生內(nèi)膜中只有少量表達;TNF-α在同種移植對照組幾乎無表達，在異種移植對照組內(nèi)皮細胞、新生內(nèi)膜強陽性表達，在沙利度胺小劑量、大劑量組內(nèi)皮細胞及新生內(nèi)膜中只有少量表達。沙利度胺小劑量、大劑量組移植動脈內(nèi)膜PCNA和TNF-α表達較之異種移植對照組下降，較之同種移植對照組升高，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05);移植動脈內(nèi)膜PCNA和TNF-α表達差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 4組大鼠移植動脈60 d后PCNA表達(免疫組織化學(xué)染色 ×200)

圖3 4組大鼠移植動脈60 d后TNF-α表達(免疫組織化學(xué)染色 ×200)

2.3 移植動脈組織PCNA和TNF-α定量表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示PCNA位于分子量36 kD蛋白帶，PCNA密度在異種移植對照組升高(P＜0.05);而沙利度胺小劑量及大劑量兩組PCNA蛋白表達低于異種移植對照組(P＜0.05)，仍高于同種移植對照組(P＜0.05)。TNF-α位于分子量17 kD蛋白帶，異種移植對照組TNF-α密度明顯升高，而沙利度胺小劑量組及沙利度胺大劑量組TNF-α蛋白表達低于異種移植對照組，仍高于同種移植對照組，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)，見圖4和表1。

圖4 各組大鼠移植動脈60 d后PCNA和TNF-α蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

3 討論

兩種MHC完全不匹配的近交系大鼠Lewis和BN大鼠之間的腹主動脈移植模型是一種簡化的慢性移植物血管病模型［4］。該模型在移植后60 d時可表現(xiàn)出典型慢性移植物血管病，具有中層細胞壞死遷移、內(nèi)膜增生及血管周圍炎癥細胞浸潤3大特點，這些表現(xiàn)與人類移植物慢性血管病的病理改變類似［5］。

慢性移植物血管病是實體器官移植術(shù)后的主要遠期并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為移植動脈發(fā)生彌漫性、增生性改變。慢性移植物血管病是導(dǎo)致器官移植受者術(shù)后移植物失功的主要原因之一。慢性移植物血管病確切發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為各種致病因子通過免疫學(xué)途徑導(dǎo)致血管內(nèi)膜損傷，激活一系列細胞因子及生長因子(IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ等)。這些因子可刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，激活動脈平滑肌細胞增殖與遷移，從而導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚、管腔阻塞，移植物因逐漸缺血而發(fā)生纖維化直至失功［6］。動脈新生血管形成與內(nèi)膜內(nèi)巨噬細胞、T淋巴細胞浸潤及TNF-α等多種生長因子刺激相關(guān)［7］。TNF-α 主要由淋巴細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，可刺激血管平滑肌細胞分泌血小板源性生長因子，后者可刺激平滑肌細胞增殖分裂。TNF-α還可促進炎癥細胞、血小板等粘附至血管內(nèi)皮細胞表面，促進血栓的形成。TNF-α在慢性移植物腎病中表達上調(diào)，并且可促進移植血管病變的發(fā)展［8］，因此移植物內(nèi)持續(xù)表達的TNF-α可作為移植物纖維化發(fā)展的臨床指標之一。

移植物失功的主要原因是移植物血管病，其中心環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮細胞增生，造成其增生的發(fā)病機制尚未完全闡明，可能與PCNA的表達增強有關(guān)。PCNA僅在增殖細胞核內(nèi)合成和表達，在調(diào)控平滑肌細胞分裂增殖過程中起重要的作用，G1晚期開始增加，S期達高峰。其量的變化與DNA合成一致，因此PCNA可視為平滑肌細胞增殖的標志，其在細胞分裂時協(xié)助DNA引導(dǎo)鏈和隨從鏈的合成，PNCA基因表達越強烈，說明平滑肌細胞的增殖越活躍［9］。檢測PCNA可以評價細胞的增殖狀態(tài)，同時，檢測PCNA的表達可以預(yù)測移植腎慢性排斥反應(yīng)的進展［10］。本研究中TNF-α和PCNA在同種移植對照組幾乎無表達，在異種移植對照組內(nèi)皮細胞及新生內(nèi)膜中強陽性表達，與文獻報道結(jié)果一致。

表14 組大鼠移植動脈內(nèi)膜厚度以及PCNA、TNF-α表達±s)

表14 組大鼠移植動脈內(nèi)膜厚度以及PCNA、TNF-α表達±s)

注:與同種移植對照組比較aP＜0.05;與異種移植對照組比較 bP＜0.05。PCNA，上皮細胞增殖細胞核抗原

images/BZ_107_233_2733_2242_2833.png同種移植對照組 8 1.70±0.29 5.79±0.76 23.32±3.81 0.21±0.020.53±0.08異種移植對照組 8 9.28±0.33 14.39±1.98a 93.72±13.60a 1.46±0.29a 1.78±0.21a沙利度胺小劑量組 8 3.60±0.32 9.87±1.14ab 55.76±6.33ab 0.88±0.13ab 1.20±0.19ab沙利度胺大劑量組 8 3.25±0.20a 10.13±1.08ab 48.25±6.49ab 0.85±0.12ab 1.13±0.14ab F值 1762.38 76.53 281.99 116.53234.33 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001＜0.001

沙利度胺(商品名反應(yīng)停)由瑞士Ciba公司于1954年合成，用于孕婦早孕反應(yīng)的鎮(zhèn)靜和止吐，20世紀60年代因致畸作用而撤出市場。后發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)作用，用于治療麻風(fēng)性結(jié)節(jié)性紅斑。1995年發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有抗血管生成作用，從而嘗試將其用于治療腫瘤性疾病。1999年，沙利度胺作為一種抗血管生成藥物被引入多發(fā)性骨髓瘤的治療并獲得空前成功。最近的研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺具有類似于甲潑尼龍的免疫抑制和抗炎作用，因此有中心在肺移植后早期應(yīng)用沙利度胺取代皮質(zhì)類固醇類藥物［11］。近10余年來，因沙利度胺對慢性移植物抗宿主病的療效已確立，還作為免疫抑制劑應(yīng)用于骨髓移植受者。動物同種異體心臟移植實驗發(fā)現(xiàn)，沙利度胺具有抗排斥反應(yīng)作用，可明顯提高受者存活率［12］。盡管沙利度胺已在臨床應(yīng)用數(shù)年，但其確切作用機制尚未完全闡明。一般認為其在抗血管生成及抑制內(nèi)皮細胞增生方面具有較強的作用。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，異種移植對照組中移植動脈呈典型的慢性移植物血管病表現(xiàn)，可見內(nèi)膜環(huán)形增厚，內(nèi)膜下少量淋巴細胞浸潤，中膜內(nèi)彈力纖維有斷裂，在中膜與外膜之間有大量淋巴細胞浸潤。而沙利度胺小劑量及大劑量組移植動脈輕度增生或未見增生，內(nèi)膜下少量淋巴細胞浸潤，在中膜與外膜之間有少量淋巴細胞浸潤，呈內(nèi)膜炎表現(xiàn)。這提示沙利度胺可能具有抑制慢性移植物血管病發(fā)展的作用。同時我們發(fā)現(xiàn)沙利度胺可以顯著減少TNF-α和PCNA在移植動脈內(nèi)皮細胞及新生內(nèi)膜中的表達，這也提示沙利度胺抑制慢性移植物血管病的發(fā)生、減輕慢性排斥反應(yīng)的作用機制可能與抑制細胞因子及生長因子的產(chǎn)生有關(guān)，如減少TNF-α對血管內(nèi)皮細胞的刺激，進而抑制動脈平滑肌細胞增殖與遷移，減輕移植物血管病變。本實驗設(shè)計的兩個沙利度胺劑量組間未見明顯差異，提示在達到一定治療劑量后沙利度胺提取物對控制移植物血管病的效果可能與用藥量無相關(guān)性。

綜上所述，本實驗通過大鼠腹主動脈移植模型提示，沙利度胺可能有延緩慢性移植物血管病的發(fā)生，減輕慢性排斥反應(yīng)作用，其機制可能與下調(diào)移植物TNF-α和PCNA的表達，從而抑制動脈平滑肌細胞增殖和遷移有關(guān)。

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