宋秀花,李文強(qiáng),馮玉芳,張景丹,石玉中△,張瑞嶺,李 毅

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,河南新鄉(xiāng) 453002;2.武漢市精神衛(wèi)生中心,湖北 武漢 430022;3.青島市精神衛(wèi)生中心,山東青島 266034)

成癮物質(zhì)在與成癮相關(guān)腦區(qū)如伏隔核,海馬及前額皮質(zhì)引起蛋白持久性的表達(dá)變化已有大量研究,而在杏仁核區(qū)蛋白表達(dá)變化卻較少報(bào)道[1-3]。條件性位置厭惡(conditioned place aversion,CPA)試驗(yàn)動(dòng)物模型被廣泛用于急、慢性阿片成癮戒斷所致的厭惡性動(dòng)機(jī)的生物學(xué)機(jī)制研究,試驗(yàn)敏感、成熟。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)是第二信使傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子之一。物質(zhì)依賴戒斷后CPA建立的過程中,有厭惡動(dòng)機(jī)/情緒的產(chǎn)生,那么特定腦區(qū)內(nèi)PKA的表達(dá)變化是不是CPA的分子基礎(chǔ),目前尚不明了。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)慢性嗎啡成癮雄性SD大鼠納洛酮催癮戒斷后CPA動(dòng)物模型的建立,定位于杏仁中央核區(qū)(central amygdaloid nuclei,CeA),測(cè)定CPA建立前后、消退后及重建后PKA蛋白表達(dá)水平。以此為毒品成癮的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

YD-1058B石蠟切片機(jī)(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠),Motic病理圖像分析系統(tǒng)(廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司),鹽酸嗎啡注射液(morphine hydrochloride injection,東北制藥集團(tuán)公司沈陽第一制藥廠生產(chǎn),批號(hào)為100305-1),鹽酸納洛酮注射液(naloxone hydrochloride injection,北京四環(huán)制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)為20100207),兔抗大鼠PKA多克隆抗體(美國(guó)Millipore公司,批號(hào)07-1468),山羊抗兔二抗(北京中杉公司,批號(hào)SP9001)。

1.2 動(dòng)物及分組

選用72只SPF雄性SD大鼠(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)SCXK(豫)2005-0001),10周齡,體質(zhì)量(200±20)g,獨(dú)立通風(fēng)籠具系統(tǒng)飼養(yǎng),顆粒型清潔級(jí)飼料[許可證號(hào):SCXK(豫)-2005-0001]飼喂,室溫(20±2)℃,自然晝夜循環(huán),非直接光照,所有實(shí)驗(yàn)均在8∶00—20∶00完成。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,大鼠自由飲水及進(jìn)食。人道主義對(duì)待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本研究共分為3組,研究組:慢性嗎啡注射+納洛酮催癮組(morphine+naloxone,MN),簡(jiǎn)稱MN組;對(duì)照組:慢性嗎啡注射+生理鹽水“催癮”組(morphine+saline,MS)和慢性生理鹽水注射+納洛酮催癮組(saline+naloxone,SN),分別簡(jiǎn)稱MS和SN組。

1.3 慢性嗎啡注射

從第1天(Day1)至第7天(Day7)的上午(共計(jì)注射6.5 d),每天兩次(8AM;8PM),每次每千克體重為10 mg,腹腔注射(ip)。慢性生理鹽水注射:按同期對(duì)照的原則,注射的均為生理鹽水。納洛酮催癮注射:在慢性嗎啡注射的第6天(Day6),0.3 mg/kg,腹腔注射一次。

1.4 慢性嗎啡依賴納洛酮催癮戒斷CPA的建立

即應(yīng)用成癮戒斷所致的厭惡動(dòng)機(jī)與特定的信號(hào)(cues,非條件刺激)結(jié)合,建立條件性反射后,形成此反射的對(duì)象再次暴露于相同或相似的信號(hào)時(shí),表現(xiàn)出明顯的厭惡動(dòng)機(jī),并出現(xiàn)回避行為。行為訓(xùn)練大致可以分為三個(gè)階段:條件化前期(preconditioning session)、條件化期(conditioning session)條件化后CPA測(cè)試期(test session)訓(xùn)練均在受聲光控制的環(huán)境進(jìn)行:照明40 lux,排氣扇白噪音(masking white noise,白噪聲:在一定頻率范圍內(nèi),功率密度和頻率無關(guān)的噪聲)50 dB。具體方法參考文獻(xiàn)[4]。

1.5 免疫組化標(biāo)本的制備

每組大鼠于CPA測(cè)評(píng)前后90 min,均隨機(jī)選取6只,腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg bw)麻醉,胸腹腔聯(lián)合切開,暴露心臟,經(jīng)左心室插管于升主動(dòng)脈,剪開右心耳,先用無菌生理鹽水150 ml快速灌注,直至流出液清亮。然后用4%多聚甲醛250 ml以先快后慢原則灌注固定30 min,取腦并將腦組織置于相同固定液中后固定2 h(4℃),參照大鼠腦部解剖圖譜,將固定后的腦組織冠狀切面取含AcbSH厚約2～3 mm腦組織切片,自來水下沖洗24 h,經(jīng)過乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟,最后進(jìn)行包埋,使用石蠟切片機(jī)將腦組織由前到后作厚度5 μ m的冠狀切片。PBS漂洗,室溫下正常山羊血清封閉1 h并振蕩,分別加一抗(兔抗PKA一抗的工作液濃度1/100),4℃孵育過夜。PBS漂洗,分別加生物素化的二抗,2 h后PBS漂洗、加ABC復(fù)合物,室溫下反應(yīng)2 h,PBS漂洗、DAB顯色,顯微鏡下控制反應(yīng),顯色滿意后0.01 mol/L PBS充分漂洗終止反應(yīng)。貼片,常規(guī)脫水透明、中性樹膠封片。陰性對(duì)照是以正常山羊血清取代一抗,其余步驟不變。

1.6 免疫組化結(jié)果的觀察與圖像分析(PKA蛋白表達(dá)測(cè)定)

每組每只動(dòng)物隨機(jī)選取含有各靶區(qū)的免疫組織化學(xué)染色切片各4張。使用Motic病理圖像分析系統(tǒng)(廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)測(cè)量陽性神經(jīng)元的平均灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠CPA評(píng)定的結(jié)果

CPA條件化后,MN組實(shí)驗(yàn)鼠在伴藥側(cè)的時(shí)間較條件化前期明顯減少,結(jié)果顯示差異有顯著性,MN組大鼠形成了明顯的CPA,MS組和SN組在伴藥側(cè)的時(shí)間結(jié)果顯示兩者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 三組大鼠戒斷體征評(píng)定結(jié)果

可數(shù)性戒斷體征評(píng)分:直接以30 min內(nèi)出現(xiàn)的總的次數(shù)表示;不可數(shù)戒斷體征(腹瀉):以30 min內(nèi)有陽性體征的實(shí)驗(yàn)鼠數(shù)目與觀察總數(shù)的比例來表示。MN組較對(duì)照組有明顯的濕狗樣抖動(dòng)(1.67±1.23)、軀體拉伸(1.22±0.67)、跳躍(1.56±1.33)和腹瀉(22/24)的表現(xiàn),而直立三組之間差別不顯著(表2)。

Tab.1 Aversion scores and time in naloxone-paired compartment at preconditioning session and test session(s,±s,n=24)

Tab.1 Aversion scores and time in naloxone-paired compartment at preconditioning session and test session(s,±s,n=24)

MN:Morphine+naloxone;MS:Morphine+saline;SN:Saline+naloxone**P＜0.01 vs preconditioning session

Group Preconditioning session Test session Aversion scores MN 608.60±50.70 445.67±42.40**-179.83±38.92 MS 578.60±87.95 526.66±63.02 -55.13±88.92 SN 553.63±86.94 550.69±78.11 -19.99±37.79

Tab.2 Withdrawal symptoms of three groups(±s,n=24)

Tab.2 Withdrawal symptoms of three groups(±s,n=24)

MN:Morphine+naloxone;MS:Morphine+saline;SN:Saline+naloxone**P＜0.01 vs MN group;##P＜0.01 vs MN group

Group Wet dog shakes Stretching Rearing Jumping Diarrhea MN 1.67±1.23 1.22±0.67 3.89±4.10 1.56±1.33 22/24 MS 0.67±0.71** 0** 1.89±1.83 0** 0/24##SN 0.56±0.53** 0** 4.44±3.78 1.00±0.87** 0/24##

2.3 大鼠杏仁核復(fù)合體區(qū)PKA蛋白表達(dá)水平

MN組PKA蛋白表達(dá)水平在CPA建立后(134.43±4.48)、消退后(141.01±3.36)及重建后(137.18±40.33)低于建立前(124.48±6.72)分別為8%,13.3%,10.2%,差異具有顯著性,CPA建立后MN組PKA蛋白表達(dá)水平高于MS組(130.67±2.40)和SN組(128.00±1.41),差異有顯著性 (圖1見彩圖頁Ⅴ)。

3 討論

目前對(duì)厭惡動(dòng)機(jī)的分子機(jī)制的研究主要集中在生物信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面,研究較多的途徑主要是腺苷酸環(huán)化酶(adenylic acid,AC)-環(huán)磷酸腺苷(cAMP)-PKA-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)途徑、鳥苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶 G途徑和Ca2+-鈣調(diào)節(jié)蛋白(calmodulin,CaM)-鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴的蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase,CaMK)-CREB等途徑,其中,PKA通路的上調(diào)是經(jīng)典途徑之一。嗎啡和其他成癮藥物反復(fù)刺激神經(jīng)元,慢性使用阿片類藥物造成胞內(nèi)信號(hào)cAMP-PKA傳導(dǎo)系統(tǒng)適應(yīng)性上調(diào),從而導(dǎo)致胞內(nèi)生活過程的一系列繼發(fā)性的改變。

本研究表明,MN組實(shí)驗(yàn)鼠在伴藥側(cè)的時(shí)間較條件化前期明顯減少,MN組大鼠形成了明顯的CPA,CPA建立后,MN組有明顯的濕狗樣抖動(dòng)、軀體拉伸、跳躍和腹瀉的表現(xiàn),Tzavara[5]等人的研究認(rèn)為慢性給予小鼠四氫大麻酚(THC),停藥后又快速給予大麻素受體拮抗劑發(fā)現(xiàn)軀體戒斷癥狀如濕狗樣抖動(dòng)次數(shù)也會(huì)相應(yīng)增加。

AC/cAMP系統(tǒng)內(nèi)部存在一個(gè)正反饋調(diào)節(jié),即AC/cAMP的上調(diào)激活了PKA,而PKA不僅能啟動(dòng)信號(hào)通路的下游信號(hào)反應(yīng),如使CREB磷酸化而改變一些基因的表達(dá)水平,還能反過來使上游信號(hào)通路中的AC受到磷酸化調(diào)節(jié)而使AC活性進(jìn)一步增強(qiáng)。AC/cAMP-PKA系統(tǒng)的這一正反饋調(diào)節(jié)可能與維持或上調(diào),以及使神經(jīng)元處于過度激活狀態(tài)有關(guān),因此可能是形成和維持嗎啡依賴狀態(tài)的一個(gè)重要機(jī)制。

研究結(jié)果表明,CPA建立后MN組CeA的PKA的表達(dá)明顯降低。杏仁中央核(CeA)是杏仁核復(fù)合體中唯一參與泛杏仁核結(jié)構(gòu)的組分,對(duì)負(fù)性情感以及物質(zhì)使用的動(dòng)機(jī)狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用,是嗎啡依賴納洛酮催癮戒斷CPA建立的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),結(jié)果有可能啟動(dòng)信號(hào)通路的下游信號(hào)反應(yīng),如使CREB磷酸化從而下調(diào)其靶基因(如NPY)的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致焦慮樣行為[6],易化了CPA的建立。

有研究者使用興奮性毒素以非連續(xù)的方式毀損雙側(cè)杏仁中央和基底外側(cè)核,來觀察上述處理對(duì)給予嗎啡依賴大鼠納洛酮催癮后所建立的CPA的影響,發(fā)現(xiàn)毀損杏仁核復(fù)合體中央核后,明顯影響了上述CPA的形成,而對(duì)杏仁基底外側(cè)核的毀損對(duì)CPA幾乎無影響。有力支持了杏仁中央核在嗎啡戒斷的負(fù)性情感成分的表達(dá)中起到關(guān)鍵作用。

PKA可促進(jìn)藥物誘導(dǎo)的突觸可塑性[7],長(zhǎng)期濫用藥物造成大腦神經(jīng)適應(yīng)性改變,這些改變導(dǎo)致行為變化并成為藥物復(fù)吸的驅(qū)動(dòng)力[8]。研究表明可卡因依賴大鼠的記憶再鞏固過程與杏仁核PKA是緊密聯(lián)系的。目前神經(jīng)突觸可塑性雙向作用原理認(rèn)為神經(jīng)生物物質(zhì)如NMDA,AMPA受體等是關(guān)鍵決定因子,提示PKA可能通過此機(jī)制增強(qiáng)物質(zhì)依賴戒斷后CPA的神經(jīng)可塑性。

總之,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示CeA內(nèi)PKA蛋白的低表達(dá)導(dǎo)致厭惡的中樞狀態(tài),可能是CPA建立的關(guān)鍵的神經(jīng)機(jī)制;CeA內(nèi)PKA的適應(yīng)性變化可能是物質(zhì)依賴戒斷后CPA相關(guān)神經(jīng)可塑性變化的重要分子基礎(chǔ)。

[1]Borgkvist A,Usiello A,Greengard P,et al.Activation of the cAMP/PKA/DARPP-32 signaling pathway is required for morphine psychomotor stimulation but not for morphine reward[J].Neuropsychopharmacol,2007,32(9):1995-2003.

[2]Self D W,McClenahan A W,Beitner-Johnson D,et al.Biochemical adaptations in the mesolimbic dopamine system in response to heroin self-administration[J].Synapse,1995,21(4):312-318.

[3]Bao G,Kang L,Li H,et al.Morphine and heroin differentially modulatein vivohippocampal LTP in opiate-dependent rat[J].Neuropsychopharmacol,2007,32(8):1738-1749.

[4]Li Y,Liu X,Chen H,et al.Development,extinction and reinstatement of morphine withdrawal-induced conditioned place aversion in rats[J].Addict Biol,2007,12(3-4):470-477.

[5]Tzavara E T,Valjent E,Firmo C,et al.Cannabinoid withdrawal is dependent upon PKA activation in the cerebellum[J].EurJ Neurosci,2000,12(3):1038-1046.

[6]Pandey S C.The gene transcription factor cyclic AMP-responsive element binding protein:role in positive and negative affective states of alcohol addiction[J].Pharmacol Ther,2004,104(1):47-58.

[7]Man H Y,Sekine-Aizawa Y,Huganir R L.Regulation of{alpha}-amino-3-hydroxy- 5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor trafficking through PKA phosphorylation of the Glu receptor 1subunit[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(9):3579-3584.

[8]Koob G F,Volkow N D.Neurocircuitry of addiction[J].Neuropsychopharmacol,2010,35(1):217-238.