攸 璞,姚 健,包曉辰,馬 駿,張 師,方以群

(海軍醫(yī)學(xué)研究所,上海 200433)

氧中毒是指由于呼吸了高氧分壓氣體后而產(chǎn)生的一種有害反應(yīng)。肺臟即為其中的主要靶器官之一[1]。在潛水作業(yè)、隧道施工等高氣壓作業(yè)環(huán)境下,作業(yè)人員會遇到長時間暴露于高分壓氧的情況,從而有引起氧中毒的風(fēng)險。而肺型氧中毒常常表現(xiàn)為胸骨后不適伴輕度干咳,并緩慢加重;然后出現(xiàn)胸骨后疼痛,且疼痛逐漸沿支氣管樹向整個胸部蔓延,吸氣時為甚;疼痛逐漸加劇,出現(xiàn)不可控制的咳嗽;最終休息時也會伴有呼吸困難[2]。因此,一旦發(fā)生氧中毒不僅大大降低作業(yè)效率,也有可能危及作業(yè)人員的生命安全。

過氧化物酶增殖體激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是核激素受體超家族的成員,是最早于降血脂藥物氯貝丁酯服用后肝臟實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的,具備介導(dǎo)過氧化物酶體增殖作用的分子[3]。對其進(jìn)一步的研究表明,該家族分子參與了多個生物過程的基因表達(dá)調(diào)控,包括脂代謝和胰島素敏感性。在PPAR相關(guān)的治療炎癥反應(yīng)的嘗試中,有大量實驗使用了PPAR配體(常見的有PGZ,TGZ,PGJ2和RGZ等)用來治療腦、肺臟、胃腸道和腎臟等組織器官的缺血/再灌注損傷模型中,這些配體主要表現(xiàn)為一種抗炎癥和抑增殖作用,尤其是PPAR-γ的配體可以抑制原炎癥基因的表達(dá),比如TNF-α,IL-1β,MMP-9,ICAM-1和iNOS等,從而達(dá)到減弱甚至預(yù)防各器官的缺血/再灌注損傷的目的[4]。既然PPAR通路在炎癥過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,因此本實驗旨在研究常見PPAR通路中的各分子在肺型氧中毒模型中的表達(dá)變化規(guī)律,為進(jìn)一步治療肺型氧中毒提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

成年雄性SD大鼠(上海市中國科學(xué)院動物中心,體重260～280 g),動物高壓氧艙(上海 7 0 1研究所楊園醫(yī)用氧艙廠),醫(yī)用氧氣(上海市江南氣體公司),鈉石灰(上海五四化工廠)。

1.2 動物分組

12只SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=3):(1)高壓常氧組;(2)高壓氧2 h組;(3)高壓氧4 h組;(4)高壓氧6 h組。以上每組動物用于芯片檢測。15只SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=3):(1)高壓常氧組;(2)高壓氧2 h組;(3)高壓氧4h組,(4)高壓氧6 h組;(5)高壓氧8 h組。高壓氧暴露方案為0.23 MPa,持續(xù)2 h、4 h、6 h、8 h。以上每組動物用于病理分析與 RTPCR檢測。

1.3 肺型氧中毒模型的制備

動物進(jìn)艙前艙內(nèi)預(yù)先放置鈉石灰(2 kg),動物進(jìn)艙后,純氧洗艙 5 min,使艙內(nèi)O2濃度＞99%,以0.1 MPa/min的速率加壓至0.23 MPa,持續(xù)微量通風(fēng),維持艙內(nèi)O2濃度＞99%。暴露相應(yīng)時間后,動物減壓出艙,進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.4 肺組織病理學(xué)檢查

動物處死后,取左肺下葉,用10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色。染色后用顯微鏡觀察拍照其病理改變。

1.5 大鼠oligo芯片檢測氧中毒時間序列表達(dá)譜

從高壓常氧組、高壓氧暴露2 h、4 h和6 h組各3只大鼠分離得到的左肺下葉,用Trizol試劑提取總RNA,經(jīng)DNA酶處理去除基因組后送公司檢測(大鼠40 k全基因組芯片)。

1.6 RT-PCR檢測

從高壓常氧組、高壓氧暴露2 h、4 h、6 h和8 h組各3只大鼠分離得到的左肺下葉,用Trizol試劑提取總RNA,經(jīng)DNA酶處理去除基因組后經(jīng)MMLV逆轉(zhuǎn)錄合成獲得第一鏈cDNA,再經(jīng)PPAR-α,PPAR-δ和PPAR-γ特異引物檢測。

2 結(jié)果

2.1 肺臟病理改變隨呼吸高壓氧時間延長而逐漸加重

在高壓氧暴露2 h后即可見到少量炎細(xì)胞浸潤(圖1B)。4 h后病理改變明顯,可見大量炎細(xì)胞浸潤,并且肺泡間隔增厚明顯(圖1BC)。有趣的是,呼吸6 h后肺臟病理改變略有減輕(圖1D),考慮為機(jī)體的一種適應(yīng)反應(yīng),但繼續(xù)延長高壓氧作用時間后肺臟病理改變劇烈,可見大量炎細(xì)胞浸潤伴有紅細(xì)胞滲漏,并有明顯滲出液(圖1E)。從而,病理結(jié)果提示,隨著呼吸高壓氧的時間延長,肺臟損傷逐漸加重,以炎細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增厚甚至有大量滲出液為主要表現(xiàn)(圖1見彩圖頁Ⅱ)。

2.2 肺型氧中毒肺組織表達(dá)譜分析

為了研究氧中毒過程中肺組織中病理改變的分子基礎(chǔ),我們采取了大鼠的全基因組表達(dá)芯片檢測了高壓氧處理后2 h、4 h、6 h以及高壓常氧肺組織的表達(dá)譜。經(jīng)過歸一化與過濾處理后可得到488條差異表達(dá)基因,進(jìn)一步經(jīng)過SOM聚類法可得4種不同表達(dá)模式的基因類(圖2),其中第四類的基因在高壓氧處理出現(xiàn)逐漸升高的表達(dá)模式,與病理改變相符,提示這類基因中含有氧中毒損傷調(diào)控關(guān)鍵基因。于是,對該類基因進(jìn)一步采用了基因本體論(Gene ontology,Go)富集分析,在被富集的功能類中可見PPAR通路中的6條基因均出現(xiàn)在第4類,這些基因包括Ucp1,Pck1,Apoa1,Apoa2,Acdc和Fabp7,經(jīng)過KEGG查詢后可知這些基因均為PPAR通路的下游靶基因,也就是說很可能在氧中毒的過程中PPAR通路得到了激活。

Fig.2 488 differential expression genes were clustered by SOM method

2.3 PPAR信號通路中配體分子的RT-PCR檢測

前面的結(jié)果提示PPAR通路可能在氧中毒模型的肺組織中激活,為了研究該通路中的上游分子PPAR各基因是否被激活,我們通過RT-PCR檢測了PPAR家族成員PPAR-α,PPAR-δ和PPAR-γ的表達(dá)情況,如圖3所示,隨著氧中毒肺組織損傷程度的加重,PPAR-δ和PPAR-γ均發(fā)生了上調(diào),而PPAR-α未能檢測到表達(dá),因此我們的結(jié)果提示PPAR通路的激活可能是通過PPAR-δ和PPAR-γ的上調(diào)來介導(dǎo)的。

3 討論

肺型氧中毒在病理學(xué)上表現(xiàn)為肺部出現(xiàn)充血、出血、滲出和炎細(xì)胞浸潤等炎癥表現(xiàn)。本研究結(jié)果提示,動物經(jīng)過高壓氧處理后,肺臟呈現(xiàn)逐漸加重的表現(xiàn),進(jìn)一步驗證了高壓氧暴露造成的肺損傷是一種炎癥反應(yīng),而且這種炎癥反應(yīng)隨著暴露時間的延長而逐漸加重。

Fig.3 Detecting expression of PPAR member genes by RT-PCR 1-3 represent repeat of lung tissues in different groups

目前已知的PPAR同種型基因一共有三個,即PPAR-α、PPAR-δ和 PPAR-γ[5]。PPAR 通路在正常狀態(tài)下,PPAR與視黃醇類X受體以異二聚體形式存在,并且受到一些協(xié)同抑制分子的作用而抑制了其活性。只有在PPAR配體出現(xiàn)的時候,使得以上協(xié)同抑制分子解離,緊接著在協(xié)同激活分子參與的情況下結(jié)合到特異的PPAR反應(yīng)元件上從而轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因。已經(jīng)證實的PPAR參與生物過程有:脂肪細(xì)胞的分化、糖脂代謝和白細(xì)胞(如單核/巨嗜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等)免疫反應(yīng)等[6]。特別的,在炎癥反應(yīng)過程中,PPAR扮演著重要的抗炎角色,大量研究顯示該類分子有抑制促炎因子釋放的作用,這些促炎因子包括細(xì)胞因子(如白介素1和6、腫瘤壞死因子α等),一氧化氮和機(jī)制金屬蛋白酶等的釋放[4,7]。而其中的機(jī)制,可能是部分通過抑制NF-κ B、AP和Stat1來實現(xiàn)的。目前有多個研究顯示PPAR通路在多種組織的缺血/再灌注損傷中有保護(hù)作用,而且已經(jīng)有部分PPAR配體類似物用于臨床預(yù)防或治療器官的缺血再灌注損傷[8]。但是,一直未見有該通路在氧中毒中的研究。本研究以肺型氧中毒為模型,研究了PPAR通路分子在氧中毒發(fā)生過程中的表達(dá)情況。

由于氧中毒是一個高壓氧的持續(xù)積累損傷作用,因此本實驗采用了不同時間點檢測肺組織損傷變化和表達(dá)譜變化。本實驗的病理結(jié)果也說明隨著暴露時間的延長,肺部損傷逐漸加重,有趣的是在6 h時間點上病理損傷略有緩解,考慮是一種機(jī)體的適應(yīng)性反應(yīng),而且在暴露了8 h后肺損傷程度最為嚴(yán)重,提示了機(jī)體的失代償表現(xiàn)。而對其表達(dá)譜分析顯示,在與損傷程度相關(guān)的類中,含有PPAR通路中的多個下游靶基因發(fā)生了上調(diào),提示了PPAR通路的激活,并且RT-PCR檢測到PPAR-δ和PPAR-γ的上調(diào),從而說明了該通路確實在氧中毒發(fā)生過程中激活。由于PPAR的抑制炎癥反應(yīng)作用,因此考慮這種隨損傷程度相關(guān)的通路激活是機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng),只是未能完全抵消氧中毒所造成的損傷,最終發(fā)生失代償。

綜上所述,PPAR通路在肺型氧中毒模型中的肺組織內(nèi)得到激活,是機(jī)體本身的一種保護(hù)性作用,該通路的進(jìn)一步激活是否能夠逆轉(zhuǎn)氧中毒所造成的肺組織損傷以及其中的調(diào)控機(jī)制還有待于下一步的深入研究。

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