張保強(qiáng) 張曉

液態(tài)芯片是美國納斯達(dá)克上市公司Luminex于本世紀(jì)初研制出的后基因組時代的技術(shù)平臺，又稱懸浮陣列、流式熒光技術(shù)，是基于多功能流式點(diǎn)陣儀 （Luminex 100）開發(fā)的多功能生物芯片平臺，是一個多功能、多指標(biāo)并行分析系統(tǒng)（見圖1）。它有機(jī)地整和了編碼微球（color-codedbeads）、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，造就了高度的檢測特異性和靈敏度，可廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體和配體識別分析等研究，也是目前唯一得到權(quán)威機(jī)構(gòu)和醫(yī)學(xué)界共同認(rèn)可用于臨床診斷的生物芯片平臺。2003年美國食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)該項(xiàng)技術(shù)用于臨床檢驗(yàn)診斷。

圖1 Luminex 100 多功能流式點(diǎn)陣儀

1 Luminex液態(tài)芯片技術(shù)的概況

1.1 工作原理

該技術(shù)的核心是采用聚苯乙烯(polystyrene)制作微球，把微小的聚苯乙烯小球（5.6 μm）包覆以不同比例的紅光及紅外光染色劑，制成100種不同顏色的微球[1]（見圖2）。將每種顏色的微球（或稱為熒光編碼微球）共價交聯(lián)上針對特定檢測物的探針、抗原或抗體。不同的微球結(jié)合了針對不同待檢測物的蛋白（抗體或抗原，用于免疫檢測）或核酸（DNA或RNA用于基因檢測），檢測抗體中以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。應(yīng)用時，先把針對不同檢測物的編碼微球混合，再加入微量待檢樣本，在懸液中靶分子與微球表面交聯(lián)的分子進(jìn)行特異性地結(jié)合，在一個反應(yīng)孔內(nèi)可以同時完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)。

檢測時，使單個的微球通過檢測通道,并使用雙色激光同時對微球上的紅色分類熒光和報告分子上的綠色報告熒光進(jìn)行檢測（見圖3）。紅色激光激發(fā)的是微球上的紅色分類熒光，根據(jù)微球的不同色彩編號，可以將微球分類，從而將各個不同的分析反應(yīng)區(qū)分開來（見圖4）。綠色激光激發(fā)的是綠色報告熒光分子，目的是確定微球上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量（見圖5）。因此，通過紅綠雙色激光的同時檢測，可以確定被結(jié)合的檢測物的種類和數(shù)量。再通過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動統(tǒng)計(jì)分析激光所檢測到微珠種類、數(shù)量，從而判定待測樣本多種目標(biāo)測試物的濃度。因?yàn)榉肿与s交或免疫反應(yīng)是在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測速度極快，而且可以在一個微量液態(tài)反應(yīng)體系中同時檢測多達(dá)100個指標(biāo)。

圖2 不同濃度的兩種顏色：紅色和紅外10種比例可以對100種微球進(jìn)行編碼

圖3 利用紅綠雙色熒光對微求進(jìn)行檢測

圖4 紅色激光激發(fā)微球的標(biāo)碼熒光（定性）

圖5 綠色激光激發(fā)二抗標(biāo)記的熒光（定量）

1.2 技術(shù)特點(diǎn)

Luminex液相芯片技術(shù)具有三大核心優(yōu)勢：①高通量，一次操作可以檢測100個指標(biāo)；②既能檢測蛋白，又能檢測核酸；③既能用于臨床，用能用于科研。此外，該技術(shù)還具有需樣本量少（檢測需樣本量僅為10μl）、高速度（最快可達(dá)10000測試/h）、靈敏度高（檢測低限為10pg/ml）、線性范圍廣（檢測范圍可達(dá)6個數(shù)量級）、重復(fù)性好、成本低、操作方便（見圖6）、數(shù)字信號、客觀可靠（見圖7）等優(yōu)點(diǎn)。

圖6 Luminex 100?多功能流式點(diǎn)陣儀工作流程

圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 Luminex液態(tài)芯片技術(shù)在臨床中的應(yīng)用

2.1 腫瘤標(biāo)志物檢測應(yīng)用

腫瘤標(biāo)志物檢測在腫瘤的早期診斷、療效檢測、預(yù)后評價、腫瘤復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)及高危人群的篩查等方面有著廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)常用的腫瘤標(biāo)志物檢測方法有酶免疫分析法、時間分辨熒光法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、液態(tài)芯片法等。由于大部分單個標(biāo)志物敏感性或特異性偏低，不能滿足臨床需要，近十年來，理論上和實(shí)踐上都提倡一次同時測定多個標(biāo)志物。腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用可提高檢測的敏感性。多腫瘤標(biāo)志物液態(tài)芯片定量檢測方法即是順應(yīng)該要求,利用液態(tài)芯片的原理和特點(diǎn)建立的一種新型腫瘤標(biāo)志物檢測方法。液態(tài)芯片技術(shù)檢測腫瘤標(biāo)志物，在一次可檢測的指標(biāo)數(shù)、標(biāo)本用量、檢測速度、重復(fù)性、減少試劑成本、平臺通用性等方面，有其明顯的優(yōu)勢。

2.2 自身免疫性抗體檢測的應(yīng)用

自身抗體泛指機(jī)體免疫系統(tǒng)受某些內(nèi)因、外因的作用對自身正?；蜃冃缘慕M織、器官、細(xì)胞、蛋白質(zhì)或酶類等自身抗原成分產(chǎn)生免疫應(yīng)答，由機(jī)體B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對自身成分的抗體。自身抗體是自身免疫性疾病的重要標(biāo)志，每種自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗體譜。病人血液中存在高效價自身抗體是自身免疫病的特點(diǎn)之一，也是臨床確診自身免疫性疾病的重要依據(jù)，對其進(jìn)行綜合檢測分析在確診及預(yù)后評估具有重要意義。

常用的自身抗體檢測方法有微孔板ELISA法、免疫印跡法、酶免疫斑點(diǎn)（條帶）試驗(yàn)等。傳統(tǒng)的檢測自身抗體的方法都存在手工操作、檢測費(fèi)時、需樣本量大等缺點(diǎn)。近幾年發(fā)展起來的液態(tài)芯片技術(shù)采用在微球表面的雙抗夾心法檢測自身抗體，可多指標(biāo)并行檢測，其檢測速度、自動化程度等均高于傳統(tǒng)方法。Rouquette 等利用液態(tài)芯片技術(shù)對九種抗核抗體（dsDNA,SSA,SSB,Sm,Sm/RNP,Scl-70,Jo-1,ribosome,and centromere B）進(jìn)行檢測，此技術(shù)的靈敏度為99.1%，特異性達(dá)到100%。

目前，國際上有BMD、Bio－Rad Diagnostics、INOVA Diagnostics、ZEUS Scientific基于液態(tài)芯片平臺開發(fā)自身免疫疾病診斷方面的產(chǎn)品。其中2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列液態(tài)芯片產(chǎn)品率先通過美國FDA認(rèn)證，成為首個得到美國FDA認(rèn)證的液態(tài)芯片產(chǎn)品。

2.3 移植配型的應(yīng)用

臨床開展的HLA分型是針對等位基因A、B、DR三個位點(diǎn)六個抗原的分析。傳統(tǒng)的血清學(xué)分型法由于其特異性、分辨率等方面的不足，已經(jīng)逐漸為分子生物學(xué)方法所替代，現(xiàn)HLA分型實(shí)驗(yàn)室多采用PCR-SSP及PCR-SSO分型法。PCR/SSP方法用設(shè)計(jì)出的一整套等位基因組特異性引物，借助PCR技術(shù)獲得HLA型別特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過電泳直接分析帶型決定HLA型別，但不易自動化、不能檢測新的等位基因、試劑盒需不斷升級。Luminex液態(tài)芯片技術(shù)進(jìn)行HLA分型，是把針對不同HLA等位基因特異性的探針與微珠結(jié)合，然后與擴(kuò)增的DNA在一個實(shí)驗(yàn)管里面進(jìn)行雜交，以流式的原理進(jìn)行檢測，這種技術(shù)在滿足有高通量、高靈敏度的同時，特異的探針技術(shù)能夠使得同一條鏈上的多態(tài)性位點(diǎn)建立一種關(guān)聯(lián)（即單倍型分析），進(jìn)一步提高了分型的特異性。Luminex液態(tài)芯片技術(shù)的PCR-SSO分型法已經(jīng)成為國家骨髓庫HLA分型的主要手段。

3 Luminex液態(tài)芯片技術(shù)在科研中的應(yīng)用

3.1 Luminex XMAP液態(tài)芯片技術(shù)檢測人乳頭瘤病毒基因型

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心( International Agency for Research on Cancer, IARC)統(tǒng)計(jì)，宮頸癌是第二大女性惡性腫瘤。人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生發(fā)展的必要條，其亞型眾多，依其致病能力不同分為高危型和低危型。HPV檢測已成為宮頸癌篩查的重要方法之一，基因芯片技術(shù)檢測與分型同時進(jìn)行，是目前HPV基因型研究的主要技術(shù)。上海透景生命科技有限公司研制的HPV DAN分型檢測液態(tài)芯片，可同時檢測26種HPV亞型，一次呈現(xiàn)，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：①明確分型，直接以亞型出具報告；②且反應(yīng)靈敏度高，檢測低限僅為6-10拷貝；③雜交反應(yīng)只需要15 min；④無需洗滌，操作簡便；⑤激光分析，數(shù)字信號，結(jié)果客觀、可靠；⑥可96孔板操作，適用于大規(guī)模篩查。

3.2 細(xì)胞因子檢測的應(yīng)用

細(xì)胞因子(cytokine，CK)是由細(xì)胞（免疫細(xì)胞、非免疫細(xì)胞）合成、分泌的具有生物活性的低分子量蛋白質(zhì)或多肽的統(tǒng)稱。細(xì)胞因子檢測在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究、揭示某些疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及診斷和治療中具有重要的應(yīng)用價值。對細(xì)胞因子水平進(jìn)行全面監(jiān)測與評價比監(jiān)測單個細(xì)胞因子更具有臨床意義，但目前的檢測方法（分子生物學(xué)法、免疫法和生物學(xué)測定法）每次只能單一檢測一種細(xì)胞因子,且存在相互干擾、靈敏度不高、測定結(jié)果變異大、操作繁瑣、費(fèi)時等問題。

應(yīng)用液態(tài)芯片技術(shù)，可以檢測白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等各種細(xì)胞因子。Tarnok等運(yùn)用液態(tài)芯片技術(shù)檢測六種促炎性細(xì)胞因子(IL-1β、6、8、10、12、TNF-α)，用于新生兒膿毒血癥早期診斷。與傳統(tǒng)的檢測方法ELISA對比，二者的檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性，但液態(tài)芯片在孵育時間、標(biāo)本用量、檢測線性范圍、檢測低限等方面均優(yōu)于ELISA法，解決了傳統(tǒng)檢測方法費(fèi)時、成本高及樣本采樣量大等缺點(diǎn)。Ray CA等在血漿中同時檢測5種細(xì)胞因子（IL-1-β,TNF-α,IL-6,IL-8,and IL-10），IL-8檢測最低限是100pg/ml，其它檢測最低限是20pg/ml，與ELISA相比，結(jié)果吻合度為84.5%，但比ELISA少用80%的樣本量，實(shí)驗(yàn)更經(jīng)濟(jì)。

3.3 在microRNA表達(dá)譜分析中的應(yīng)用

MicroRNA是一種非編碼的短鏈RNA序列，它們在多種生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵作用，部分腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了miRNA的表達(dá)異常，但miRNA的表達(dá)在腫瘤診斷中的價值尚未有過系統(tǒng)的研究。由于miRNA的序列很短（大約21bp），且不同序列家族之間的相似性非常高，現(xiàn)有方法用于miRNA研究時存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，因此需要一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的新方法。有研究利用液芯技術(shù)對334個包括多種人類腫瘤標(biāo)本的217個哺乳動物miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明miRNA表達(dá)譜能夠反映腫瘤的組織來源和分化狀態(tài)，還發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的miRNA表達(dá)普遍下調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)，通過分析miRNA表達(dá)譜，可以成功地對分化程度很差的腫瘤進(jìn)行分類，而mRNA的表達(dá)譜在應(yīng)用于同一個樣本時的準(zhǔn)確性極低。這些結(jié)果表明miRNA表達(dá)譜分析在腫瘤診斷中有著重要的應(yīng)用價值。液態(tài)芯片技術(shù)用于microRNA表達(dá)譜分析，不但準(zhǔn)確型高、特異性好，而且可以方便地用做常規(guī)檢查。

3.4 傳染病的診斷

目前，國外有報道通過將病原體的診斷抗原或變態(tài)反應(yīng)原固定在微球表面上，實(shí)現(xiàn)對多種傳染性疾病如艾滋病（HIV）、麻疹、單純皰疹、流行性腮腺炎等進(jìn)行快速診斷[2-3]。

液態(tài)芯片是較為理想的的臨床應(yīng)用型生物芯片，是唯一得到美國FDA批準(zhǔn)的芯片類技術(shù)[4]，也是唯一被納入美國臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控網(wǎng)絡(luò)的診斷芯片。作為近幾年來發(fā)展起來的新技術(shù)，液態(tài)芯片在腫瘤標(biāo)志物檢測、自身抗體檢測、HLA分型、HPV基因分型、細(xì)胞因子、傳染病檢測等方面有了廣泛的應(yīng)用。但此技術(shù)目前仍有不成熟之處，在縮小微球的球粒，使反應(yīng)體系更接近液相環(huán)境；降低多指標(biāo)檢測時不同抗體間或抗體與樣品蛋白之間可能存在的相互影響等方面還需要不斷改進(jìn)。但可預(yù)見，液態(tài)芯片技術(shù)作為生物信息學(xué)先進(jìn)的操作技術(shù)平臺,必將在臨床和科研各方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

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