王小梅，穆長(zhǎng)征，趙田田，楊穎婷

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第一醫(yī)院，2.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

糖尿病心肌病是糖尿病的微血管病變之一，獨(dú)立于高血壓和冠狀動(dòng)脈病變發(fā)生，1972年由Rubler首次提出，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，可能與能量代謝異常、氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活、炎癥反應(yīng)等有關(guān)，病理改變包括細(xì)胞凋亡、心肌肥大和心肌纖維化等。近年來研究發(fā)現(xiàn)心肌組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/Smad信號(hào)通路活化與糖尿病心肌病的發(fā)病有密切關(guān)系［1-2］。通心絡(luò)膠囊是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制而成的含多種蟲類的中藥復(fù)方制劑［3］，臨床用于治療冠心病心絞痛取得良好療效，并在高血壓大鼠和病毒性心肌炎小鼠發(fā)病過程中具有明顯抗心肌纖維化作用。超微粉碎(干粉)的通心絡(luò)是對(duì)通心絡(luò)膠囊中動(dòng)物藥進(jìn)行超微粉碎，有利于有效成分的溶解和釋放，使中藥的生物利用度更高、吸收更充分、藥效更好［4］。本研究將通心絡(luò)干粉用于鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，觀察其對(duì)糖尿病大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3和Smad7的表達(dá)的影響，探討通心絡(luò)對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的防治作用及可能的機(jī)制。

1 材料

通心絡(luò)干粉(主要由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲、赤芍、蟬蛻、冰片組成)，每1 g干粉相當(dāng)于生藥1.43 g，河北以嶺醫(yī)藥研究院，批號(hào):070406。

兔抗鼠 TGF-β1、Smad3、Smad7抗體，北京博奧森生物有限公司。

引物合成設(shè)計(jì)由大連寶生物工程有限公司進(jìn)行引物合成。

血糖測(cè)定儀，美國(guó)強(qiáng)生公司SureStep Plus(穩(wěn)步倍加型);CTAS-1000細(xì)胞圖像分析儀，北京大恒圖像視覺有限公司。

健康雄性SD大鼠，鼠齡7～8周，體重180～220 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SYXK(遼)2005-0013。

2 方法

2.1 糖尿病模型的建立、分組及標(biāo)本取材

SD大鼠40只，其中10只作為正常對(duì)照組(注射等量0.5 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液)，另外30只尾靜脈注射1%STZ溶液(用 pH 4.5，0.5 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液配制)45 mg/kg。72 h后尾靜脈取血測(cè)定血糖，以血糖濃度大于16.7 mmol/L定為糖尿病模型建立標(biāo)準(zhǔn)。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為2組:糖尿病模型組和通心絡(luò)組。參照文獻(xiàn)［5］，通心絡(luò)組給予通心絡(luò)干粉0.5 g/kg，溶于水中后灌胃給藥，正常對(duì)照組和糖尿病模型組灌胃相同體積的水，共12周。12周末，稱體重，腹腔注射20%烏拉坦溶液0.5 mL/100 g麻醉，取心臟，4℃生理鹽水漂洗后濾紙吸干全心稱重，去除心房、右心室，稱左心室重，將左室心肌標(biāo)本橫切分為兩份，中下段凍存于－80℃冰箱，用于RT-PCR檢測(cè)。左室中上段取5 mm3心肌組織，迅速放入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片用于光鏡及TGF-β1，Smad3和Smad7蛋白的免疫組織化學(xué)測(cè)定。

2.2 血糖、心臟重量指數(shù)、左室重量指數(shù)測(cè)定

尾靜脈取血，血糖儀及血糖測(cè)定試紙測(cè)血糖。計(jì)算大鼠心臟重量指數(shù)(全心重量/體重)和左心室重量指數(shù)(左心室重量/體重)。

2.3 膠原容積積分(CVF)測(cè)定

取心肌組織5 mm3，迅速放入10%甲醛溶液中固定后組織脫水，石蠟包埋，制備組織切片行HE染色及VG膠原染色(在VG染色下，心肌細(xì)胞、紅細(xì)胞呈黃色，間質(zhì)膠原纖維呈紅色)。鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化，圖像分析儀測(cè)量CVF。

2.4 免疫組化測(cè)定心肌中TGF-β1、Smad3及Smad7的蛋白表達(dá)

心肌組織切片常規(guī)二甲苯、梯度乙醇脫蠟、抗原修復(fù)，血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下見棕黃色為陽性表達(dá)。每組標(biāo)本切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，采用CTAS-1000細(xì)胞圖像分析儀計(jì)算各組陽性表達(dá)平均灰度值，進(jìn)行分析。

2.5 RT-PCR 法檢測(cè) TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA表達(dá)

?。?0℃凍存的心肌組織，置入盛有液氮的研缽中，加入Trizol 1 mL，用研磨棒仔細(xì)研磨，抽取勻漿，提取總RNA。按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。TGF-β1的引物:上游:5'ATGGTGGACCGCAACAAC3'， 下 游:5'TGAGCACTGAAGCGAAAGC3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為329 bp;Smad3的引物:上游:5'GATGTGGCTGGGAAATAC3'，下游:5'TTCTAGTCAGTCTGCCTGTAC3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為74 bp;Smad7的引物:上游:5'CCCTTTGGATCAGCATTTC3'，下游:5'GGTTCTGGTTCAGCCTTCTA3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 345 bp;β-actin的引物:上游:5'GAAATCGTGCGTGACATTA3'，下 游:5'GGACTCATCGTACTCCTGCT3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 477 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s;退火30 s;72℃延伸30 s，72℃ 7 min，4℃保存，33個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上掃描，通過圖像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度值檢測(cè) TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA 表達(dá)相對(duì)含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用(x±s)表示，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

注射STZ后，大鼠逐漸出現(xiàn)多尿、多飲、多食等糖尿病癥狀，體重增長(zhǎng)緩慢，伴有不同程度的精神萎靡，皮毛稀疏無光澤，2只大鼠血糖低于16.7 mmol/L，棄去，至實(shí)驗(yàn)?zāi)┨悄虿∧Ｐ徒M大鼠因感染或糖尿病加重死亡2只;通心絡(luò)組死亡1只，其余25只大鼠均達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 通心絡(luò)對(duì)糖尿病大鼠血糖、心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)的影響

12周時(shí)，糖尿病模型組大鼠血糖明顯高于正常對(duì)照組，心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)明顯升高;通心絡(luò)組與糖尿病模型組相比，血糖無明顯差異，心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)明顯降低，但仍高于正常對(duì)照組，見表1。

3.3 CVF 的變化

與正常對(duì)照組相比，糖尿病模型組大鼠CVF明顯增高;與糖尿病組相比，通心絡(luò)組CVF明顯降低，但仍高于正常對(duì)照組，見表1。

3.4 大鼠心肌TGF-β1、Smad3及Smad7的蛋白表達(dá)

正常對(duì)照組大鼠心肌TGF-β1、Smad3的蛋白表達(dá)在心肌細(xì)胞漿中、細(xì)胞外周、血管周圍出現(xiàn)棕黃色顆粒物質(zhì)，呈弱陽性改變，而Smad7的蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性;糖尿病模型組大鼠心肌TGF-β1、Smad3的蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性，而Smad7表達(dá)明顯減少;與糖尿病模型組比較，通心絡(luò)組TGF-β1、Smad3表達(dá)明顯減少而Smad7表達(dá)明顯增多。見表2。

3.5 大鼠心肌 TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA 的含量測(cè)定

與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組 TGF-β1、Smad3mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，Smad7mRNA表達(dá)顯著下降;與糖尿病組相比，通心絡(luò)組 TGF-β1、Smad3mRNA表達(dá)顯著降低，Smad7mRNA表達(dá)顯著增高。見表3和圖1。

表1 三組大鼠血糖、心臟重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)及CVF的比較(x±s)Tab.1 The comparison of blood glucose，heart weight index，left ventricular weight index and CVF in the three groups(x±s)

表2 三組大鼠心肌TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)比較(x±s)Tab.2 The expression levels of TGF-β1，Smad3，Smad7protein in the three groups(x±s)

表3 三組大鼠心肌TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA表達(dá)比較(x±s)Tab.3 The expression levels of TGF-β1，Smad3，Smad7mRNA in the three groups(x±s)

4 討論

糖尿病心肌病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心肌間質(zhì)膠原纖維沉積和心肌纖維化是糖尿病心肌病變的一種重要特征，心肌纖維化增加了心室壁僵硬度，降低了心室順應(yīng)性，致心室舒縮功能障礙，早期以舒張功能障礙為主，最后發(fā)展為收縮功能不全。有研究表明，TGF-β1過度表達(dá)可促進(jìn)心肌纖維化和心肌肥厚而導(dǎo)致心室重構(gòu)，參與心肌纖維化發(fā)生的早期過程［6］。TGF-β1是一類多功能細(xì)胞因子，在纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要重要，是組織器官纖維化的主要調(diào)控因子之一［7］，其高表達(dá)具有促組織發(fā)生纖維化的病理作用，它可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解;增加膠原與基質(zhì)蛋白的生成;最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而引起心肌纖維化［8］，本研究結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠心肌TGF-β1、TGF-β1mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，說明糖尿病大鼠心肌纖維化可能與 TGF-β1過度表達(dá)有關(guān)，該結(jié)果與章怡袆等［9］的結(jié)果一致。而通心絡(luò)組TGF-β1表達(dá)有所減少，說明通心絡(luò)可降低糖尿病心肌病中TGF-β1的表達(dá)，從而緩解糖尿病心肌病的發(fā)生與發(fā)展。

圖1 RT-PCR觀察鼠心肌組織TGF-β1mRNA(A)、mad3mRNA(B)和mad7mRNA(C)表達(dá)Fig.1 The expression of TGF-β1mRNA(A)，mad3mRNA(B)and mad7mRNA(C)in heart muscle tissue with the way of RT-PCR

Smad作為TGF-β1的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，同樣參與了糖尿病心肌病病理改變。已有研究證實(shí)心臟Smad可能在新生血管形成、心肌肥厚和心力衰竭中發(fā)揮重要作用，其中，Smad7為抑制性Smads蛋白(I-Smads)，被認(rèn)為是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上最重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一，可與Smad2、Smad3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 TGF-β1，阻止 Smad2、Smad3磷酸化而阻斷TGF-β1信號(hào)向下傳導(dǎo)［10-11］。本研究觀察到，糖尿病大鼠心肌Smad3、Smad3mRNA表達(dá)增加，而Smad7、Smad7mRNA的表達(dá)減少，提示Smad3可能參與了糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程，Smad7通過對(duì)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上最重要的負(fù)性調(diào)節(jié)，使TGF-β1表達(dá)減少，從而起到對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)作用。通心絡(luò)干粉主要由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲、赤芍、蟬蛻、冰片組成，趙田田等［12］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)降低心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)與TGF-β1蛋白的表達(dá)及含量，起到預(yù)防糖尿病心肌纖維化的作用，而本研究發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)組明顯上調(diào)Smad7、Smad7mRNA的表達(dá)，下調(diào)Smad3、Smad3mRNA的表達(dá)，表明通心絡(luò)可影響 TGF-β1的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過下調(diào)TGF-β1、Smad3的表達(dá)和上調(diào) Smad7表達(dá)，減輕心肌纖維化，進(jìn)而對(duì)糖尿病大鼠心肌組織起到保護(hù)作用。由于通心絡(luò)的配方是含多種蟲類中藥的復(fù)方制劑，目前尚不清楚發(fā)揮上述作用的是單一成分還是復(fù)合成分，有待于進(jìn)一步研究。

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