寧佳 張瑋 　 柳洪志

骨組織再生過程發(fā)生異常會導致骨量或骨質結構的改變。而臨床中涉及骨組織再生的領域甚多，如：骨折的修復重建、骨腫瘤術后骨缺損的修復，尤其在種植外科領域中齒槽嵴的增高、上頜竇提升術、種植體植入后周圍支持骨的修復所涉及到的骨組織再生和修復問題是近年研究的熱點之一。因此，深入研究骨組織再生和修復的過程，對于臨床應用具有十分重要的意義。新一代的血漿提取物-濃縮生長因子（CGF，Concentrate Growth Factors），在骨組織再生和修復中的作用越來越引起人們的關注。本文就濃縮生長因子在骨組織再生和修復上的作用研究進展綜述如下。

1 CGF的發(fā)展史

50年前醋酸纖維素過濾器被用于神經(jīng)和肌腱再生實驗[1]，Murray等[2]在狗的腿骨缺損區(qū)應用一種塑料支架，這種方法促使缺損區(qū)有大量新骨生成。Hurley等[3]在兔子和老鼠的顱骨缺損區(qū)安放機械屏障也有成功的骨再生效果[4-5]，這些研究提供了大量的證據(jù)，表明機械屏障能阻止軟組織進入骨缺損區(qū)，顯著提高骨再生和修復。然而，大多數(shù)早期研究者的成功歸功于他們意識到屏障膜的保存及保護血凝塊的作用，但沒有意識到屏障膜為成骨細胞創(chuàng)造了獨立封閉的空間。1982年，Nyman[6]第一次把屏障膜技術用于牙周病的治療獲得成功，并提出了引導組織再生（Guided Tissue Regeneration，GTR）的概念，其后GTR技術成為牙周病治療的一項常用手段。1993年，Buser等[7]提出了引導骨再生的概念?，F(xiàn)在，GBR技術已被廣泛應用在牙槽外科、牙周科和口腔種植領域。在GBR技術中各種骨替代材料與血漿提取物的混合使用在目前的臨床應用中被廣泛使用。而血漿提取物的研究大致經(jīng)歷了Platelet-rich plasma（PRP），Platelet-rich fibrin（PRF），Concentrate Growth Factors（CGF）三個階段。1984年，Assoion等[8]發(fā)現(xiàn)了人血漿中提取的富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）中含有多種生長因子，當PRP與氯化鈣以及牛凝血酶混合后，各種生長因子即從血小板中的α顆粒中釋放出來。它是一種自體來源的通過梯度離心獲得的富含血小板衍生生長因子和轉化生長因子β等的血漿提取物[9]。1993年，Hood等[10]提出了PRP凝膠（PRPgel ）概念，亦即血小板凝膠（platelet gel）。PRP gel是纖維素凝膠的一種改良應用，由自體全血離心產(chǎn)生PRP，然后與凝血酶和氯化鈣混合而成的一種具有粘性的膠狀凝塊。PRP凝膠與纖維素凝膠最本質的區(qū)別是PRP凝膠含有高度濃縮的血小板及其固有的濃縮的纖維素原。血小板被凝血酶激活，釋放出一系列的因子而發(fā)揮其作用。PRP凝膠最初被作為一種生物凝膠和屏障膜而應用于臨床[11]。1997年，Whitman率先將自體的PRP應用于口腔臨床研究中并取得了良好效果，隨后PRP技術成為口腔種植骨缺損修復和骨整合研究中的熱點[12]。目前，對于PRP的研究和應用還存在較大爭議。主要集中在PRP的確切作用機制、PRP能發(fā)揮作用的劑量、PRP的安全性問題、PRP能否引起感染等[13]。

作為第二代濃縮血小板，富血小板纖維蛋白（PRF）是由Choukroun首次引入的[14]。PRF是富纖維蛋白凝膠，由患者靜脈中抽取的新鮮血液制作而成，屬于新一代的血小板濃縮物，它制備簡單無需任何生物添加劑的處理。它緩慢的聚合似乎形成了類似自然的纖維網(wǎng)絡。在PRF通過離心分離的制備過程中，血小板被激活的同時大量脫顆粒細胞中蘊含的重要的生長因子釋放出來，在對PRF進行加工的同時白細胞也隱藏在細胞因子中，對炎癥和止血起到作用，并且加速組織愈合和血管生成，組織學評估表明PRF能夠縮短骨形成時間[15]。PRF方案無需凝血酶之類的化學添加劑即可制成凝膠狀物體。因此，PRF無交叉污染之憂。濃縮生長因子（CGF）是Sacco首次開發(fā)出來的[16]。與PRF一樣，CGF由靜脈血分離制作而成。不過，該技術的離心速度有所不同。CGF是一種具有完全獨特屬性的愈合型生物材料。外科醫(yī)生可以將CGF作為隔膜來加速軟組織愈合或與骨移植物混合，以加快新骨重建。CGF無需任何化學或過敏性添加劑（如：凝血酶或抗凝劑），因此，不會引起病毒性傳染病。

2CGF的基本原理和分離技術

2.1基本原理：CGF血纖維蛋白分子結構為三鍵式聯(lián)結，呈立體網(wǎng)狀結構，可有效地滯納血小板及各種循環(huán)分子（如細胞因子）。當CGF應用于損傷的組織時，通過引導損傷組織的再血管化，免疫調節(jié)以及捕獲循環(huán)血中的干細胞，最終促進組織愈合再生和修復。

2.2分離技術：將患者的靜脈血采集10ml于試管中，并立即放入Medifuge（Silfradent，意大利）離心加速機分離處理。設定制備CGF程序，旋轉12min后，可見試管中分為三層（最上層為細胞質，中間纖維蛋白凝結物即CGF，底層為紅細胞及血小板），將血清分離出來，并存儲在特定的存儲器皿中。CGF被分離出來（其中大量的生長因子位于中間層與底層的界面上，所以分離的時候應一并分離出來），并存儲在稀釋的抗菌溶液中（Lincocin 600mg）。底層的紅細胞部分及血小板立即存儲在器皿中，其中富含紅細胞、血小板以及鐵、鈣和其他基本元素、可以用來制備截骨術中的填料，以便混合生物材料及自體骨。將CGF切割成1～2mm的微粒，隨后依次與收集的紅細胞部分和骨代材料混合。為增加混合物的柔軟度，可添加一些血清。使用特定的收集設備（Silfradent 意大利）旋轉6s左右將其混合并攪勻。另外，CGF具有極大的可模制性，通過壓縮，以薄膜的形式使用，也可以將其撕裂，以碎片的形式使用。

3 CGF的主要成分及生物學特性

CGF是一種修補生物材料，其中含有濃縮生長因子及纖維蛋白，具有改善并增強組織再生的獨特性質，是再生醫(yī)療領域中組織刺激的新技術。CGF技術是以患者自身靜脈血為原料，通過梯度密度離心的方法，將其分為血漿細胞活素類、血小板、活性纖維蛋白、粒性白細胞、濃縮生長因子、抗體，再單獨或聯(lián)合其他生物材料注入硬組織缺損或軟組織創(chuàng)傷處，從而修補缺損，誘導生長，加速局部創(chuàng)傷的愈合并提高愈合質量。其中的濃縮生長因子包含：轉移生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、類胰島素生長因子（IGF）、骨形成蛋白（BMPs）、血管內皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子（EGF）以及成纖維細胞生長因子（FGF）等[17-18]。CGF具有柔性成型血凝塊及彈性有機纖維蛋白網(wǎng)格，促進血管生成及移植物存活，從血小板及濃縮纖維蛋白中釋放出的生長因子的生物學特性，并具有修復促進和調節(jié)功能。

4 CGF在創(chuàng)口愈合過程中的作用

創(chuàng)口愈合過程可分為三個不同的階段：生化活動階段、細胞活動階段和細胞反應階段[19]。生化活動階段即把機械損傷轉化為機體能接受的生化信號，這一反應是由血清中的Hagemann因子啟動的。當機體受損傷后，創(chuàng)緣間充以血液和含有纖維蛋白的滲出液，并迅速凝集成塊[20]，而血清中的Hagemann因子則引起局部微循環(huán)障礙，血漿與組織蛋白和基底膜接觸，這樣便激活了Hagemann因子和血循環(huán)中的血小板。被激活后的Hagemann因子反過來再促進上述反應進一步生成，并導致細胞活動開始，在組織內出現(xiàn)白細胞和巨噬細胞浸潤，并侵入血塊將死亡的細胞，可能存在的細菌及無活力的組織吞噬消化，凝血反應產(chǎn)生纖維素促進止血，凝血酶則引起血小板a粒子的釋放。補體系統(tǒng)產(chǎn)生許多生物活性分子，包括C5a、CD34，對中性粒細胞和單核細胞起趨化吸附作用。同時，血漿中的血漿酶降解纖維素，得到的纖維素降解產(chǎn)物是一種自我活化的生物分子，可使單核細胞遷移和血管舒張。在此階段中，CGF通過血小板釋放各種生長因子，促進產(chǎn)生新的血管，引導損傷組織進行再血管化，進行自身的免疫調節(jié)以及捕獲循環(huán)血中的干細胞（全能干細胞、多能干細胞、單能干細胞），使細胞移到缺損區(qū)。細胞反應階段開始作用主要靠組織細胞、成纖維細胞滲入血凝塊，組織細胞可分化為成纖維細胞，具有膠原的能力，血漿和血細胞因子起到修復、消炎和止痛作用，血小板傳遞信號，釋放最重要的PDGF，TGF-β和IGF-1生長因子，使局部的間葉細胞、上皮細胞、成纖維細胞、成骨細胞等相關細胞進行遷移、分化和增殖。在細胞反應的最后階段，單核細胞轉化為巨噬細胞，并輔助中性粒細胞加強機體防御，促進創(chuàng)口愈合。

5CGF的臨床應用

許多臨床報道表明，CGF在口腔頜面外科下頜骨缺損重建、齒槽嵴增高和上頜竇提升術、種植外科領域的骨組織修復重建中起積極的促進作用。Corigliano[21]報道1例36歲男性患者，╂出現(xiàn)腫脹和復發(fā)性瘺管。X光照片顯示整個牙周區(qū)存在根尖病變?；颊呱眢w健康，由于其牙周發(fā)生病變，我們決定拔除牙齒并植入修復性壓根。接著，從患者的前臂采集8份血樣，按照CGF方案用Medifuge（Silfradent，意大利）進行分離處理。麻醉之后，小心地將牙齒拔除，避免傷及殘存的皮層。然后深入牙根尖2mm探查骨的狀況，以非常慢的速度實施截骨術，此過程不使用水。接著植入修復性牙根，拔牙后留下的種植體空間為4.7mm×15mm。隨后用纖維蛋白微粒和自體骨（截骨術過程中采集）以及凝塊的混合物填充牙根修復體和牙槽骨之間的空隙。隨后用一些交叉的纖維蛋白膜填補拔牙后形成的牙槽空洞，以便恢復受損的組織。此過程將保護并刺激傷口，因為它將移植物隔離，另外，由于纖維蛋白具有一定的光強度，能傳輸骨膜和周圍的GF釋放的愈合信號，有利于傷口愈合。手術完成后，用復合材料對牙冠進行粘接，已達到美觀的目的。在15、30、45天對患者進行X光檢查，60天后骨再生完成，可對患者實行牙冠修復治療。Dong-Seok等[22]將CGF用于上頜竇提升術，同時CGF隔膜用于引導組織再生。最近許多報道亦表明，CGF可以跟骨粉混著使用，加速骨細胞生長；也可以直接鋪在縫合傷口內，讓傷口愈合速度增加約五倍，直接填充CGF以形成骨。某男性患者來我院以“外傷后牙槽骨缺損”就診。其上頜右上┼缺失，牙槽嵴高度降低，周圍牙齦無紅腫壓痛；┼松動I°，無叩痛，牙體伸長偏頰側，咬合關系不良；右下┼缺失，牙槽嵴呈刃狀。經(jīng)X線檢查后，診斷為嚴重的垂直和水平骨重吸收。因此，決定拔牙后實施骨移植再生手術。我們使用了自體骨（從髂骨提?。〣io-oss，與CGF碎塊進行混合，并根據(jù)覆蓋面積制CGF膜。由于骨原細胞濃縮液、生長因素、細胞因子和纖維蛋白及其促使活性細胞陷入CGF的結構，也由于Bio-oss的骨傳導性，CGF與自體骨、Bio-oss和血液混合后能在單一手術中完成干預工作。用CGF進行治療的所有臨床病例中，骨和軟組織再生的情況良好，而且時間縮短一半。傷口具有極強的抗感染能力，降低了術后發(fā)生細菌感染的風險。膜層中添加的CGF可形成一道堅固的屏，它使用方便，具有較強的粘合力和浸透性，值得臨床推廣應用。

6問題與展望

CGF來源于自體本身，無毒性和免疫原性，不會存在免疫排斥反應，簡單而費用低廉的方案，基于自然生物機制。CGF具有促凝血作用，能夠促進組織的再生，加速缺損區(qū)的愈合。CGF和新鮮的活體自體骨的混合對骨再生最為理想。這就是CGF成為目前的可靠技術的原因，CGF與其他所有血小板濃縮液（特別是PRP）的不同在于其提取技術，而且除血液外，它無需添加任何合成或催化成分即可促進血液轉型（PRP需要添加牛凝血酶和氯化鈣）。CGF其制備工藝、生化特性、結構、凝結物組成、纖維蛋白結構、血小板細胞因子作用、白細胞活化作用、CGF和骨細胞間可能的相互作用、用于軟組織和骨再生的可能性，這些因素使得CGF成為一種發(fā)展迅速的生物材料，臨床應用安全，其應用前景應十分廣闊。

CGF具有濃縮生長因子的促生長和愈合能力，有利于所有再生組織的恢復。盡管CGF具有如此多的優(yōu)點，但在進行引導骨再生的過程中仍然需要與自體骨或骨代材料混合來加速骨再生速度，這樣做增加了術區(qū)或引起一些并發(fā)癥。若能僅用CGF而無需與自體骨或骨代材料混合來促進成骨，將是未來的一個研究方向。CGF含有高濃度生長因子的凝膠狀纖維蛋白塊，由在制造過程中血小板釋放出的高濃度生長因子激活。應用在需要再生的組織上，顯著地加速修復過程。因此，濃縮生長因子（CGF）為骨組織再生和修復提供了新的思路，也為應用骨再生方法治療頜面部骨組織缺損提供了新的理論依據(jù)。

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[收稿日期]2012-08-20 [修回日期]2012-10-09

編輯/李陽利