張培華　李小川　李瑾　鄒雅琴　梁杰

[摘要]目的：探討重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的IL-32基因抑制人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（Keloid fibroblasts，KFs）增殖的機(jī)制。方法：用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的IL-32（rAAV2 IL-32）及腺相關(guān)病毒空載體感染人KFs，通過熒光顯微鏡觀察rAAV2 IL-32的感染效率，RT-PCR法檢測(cè)IL-32的轉(zhuǎn)錄水平；用MTT法檢測(cè)KFs增殖的情況；用蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果：rAAV2 IL-32及腺相關(guān)病毒空載體感染KFs 48h后，RT-PCR檢測(cè)顯示rAAV2 IL-32組出現(xiàn)高表達(dá)電泳條帶，而腺相關(guān)病毒空載體組則未出現(xiàn)電泳條帶；MTT法檢測(cè)顯示rAAV2 IL-32組明顯抑制了KFs的增殖；蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示rAAV2 IL-32組KFs中Bcl-2、TGF-β1表達(dá)降低，BAX表達(dá)增高。結(jié)論：rAAV2 IL-32 可能是通過減少KFs中Bcl-2和TGF-β1的表達(dá)以及增加BAX的表達(dá)來抑制瘢痕疙瘩的增殖。

[關(guān)鍵詞]白細(xì)胞介素32；瘢痕疙瘩；Bcl-2；TGF-β1；BAX

[中圖分類號(hào)]R619+.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）11-1987-04

人白介素32 （interleukin-32， IL-32）最早于1992年由Dahl等[1]提出，2005年Kim SH等[2]研究發(fā)現(xiàn)其有多種炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子的特性。目前研究證實(shí)IL-32不僅可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，而且在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用[3]，臨床上已經(jīng)用于防治腫瘤和結(jié)締組織疾病的研究 [4]。瘢痕疙瘩具有腫瘤樣生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，是一種自身免疫性、炎癥性疾病[5]。有關(guān)重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的IL-32基因（rAAV2 IL-32）抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（Keloid Fibroblasts，KFs）增殖的機(jī)制研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，由此，筆者通過構(gòu)建IL-32基因重組腺相關(guān)病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染KFs，研究IL-32基因?qū)Fs增殖的影響及機(jī)制探討，從另一角度認(rèn)識(shí)瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制，可能從分子水平上為瘢痕防治提供新的思路。

1材料和方法

1.1 材料：rAAV2 IL-32及重組腺相關(guān)病毒空載體（廣州萊德爾生物科技公司設(shè)計(jì)提供），KFs（廣東醫(yī)學(xué)院整形外科研究所），小牛血清和DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），MTT（Sigma公司），IL-32引物：IL32-F TCCCGAAGGTCCTCTCTGAT，IL32-R CATAATAAGCCGCCACTGTCT、BCL2引物：BCL2-F TCATGTGTG TGGAGAGCGTC，BCL2-R AGCCTCCGTTATCCTGGATC、BAX引物：BAX-F GATGCGTCCACCAAGAAGCT，BAX-R CGGCCCCAGTTGAAGTT G、TGF-β1引物：TGF-β1-FCACGTGGAGCTGTACCAGAA，TGF-β1-R GAACCCGTTGATGTCCACTT、18srRNA引物：18srRN A-F CCTGG ATACCGCAGCTAGGA、18srRNA-R GCGGCGCAATACGA ATGCCCC（上海生工生物科技有限公司合成）。人IL-32、Bcl-2、BAX、TGF-β1抗體（北京博爾邁生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 重組腺相關(guān)病毒載體rAAV2-IL-32的病毒滴度測(cè)定：應(yīng)用CMV探針（地高辛標(biāo)記）點(diǎn)雜交方法檢測(cè)病毒液中rAAV2-IL-32的物理滴度（以病毒基因組數(shù)/ml，vg/ml表示）。準(zhǔn)確定量質(zhì)粒SV40，用稀釋緩沖液（梯度稀釋后）點(diǎn)樣尼龍膜上；待測(cè)病毒液rAAV2-IL-32樣品用DNase I和RNase稀釋，終濃度均為1μg/ml，于37℃消化1h，提取rAAV2 DNA， 100℃水浴5min變性，置于冰浴中。按試劑盒說明以一定比例稀釋緩沖液后點(diǎn)膜。按Boehringer Mannheim公司試劑盒說明書，再進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、洗膜、顯色。通過計(jì)算IL-32的拷貝數(shù)、再乘以與其雜交信號(hào)強(qiáng)度一致的病毒液樣品的稀釋倍數(shù)而得出rAAV2-IL-32的物理滴度，滴度計(jì)算公式：滴度（v.g./ml）= 雜交信號(hào)對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)×2×稀釋倍數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：KFs的培養(yǎng)：含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃，5% CO2）培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)進(jìn)行消化、傳代。實(shí)驗(yàn)用3～4代細(xì)胞。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察rAAV2-IL-32感染效果：按照常規(guī)方法擴(kuò)增腺相關(guān)病毒，分別以感染復(fù)數(shù)（MOI）103，104，105的比例感染KFs，通過熒光顯微鏡觀察感染48h后EGFP的表達(dá)，并以此選擇最佳感染濃度。

1.2.4 RT-PCR方法檢測(cè)IL-32轉(zhuǎn)錄表達(dá)：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收獲1×105細(xì)胞，離心沉淀，抽提總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用IL-32的引物做PCR檢測(cè)，PCR的反應(yīng)條件為94℃ 4min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。

1.2.5 MTT法檢測(cè)rAAV2-IL-32對(duì)KFs增殖的影響：以10%小牛血清DMEM配成濃度為1×105/ml的細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板；每孔100μl，37℃、5% CO2孵育過夜；分別以感染復(fù)數(shù)（MOI）103，104，105的比例加入IL-32及腺相關(guān)病毒空載體作為對(duì)照（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔），37℃、5% CO2孵育72h后，每孔加MTT（5mg/ml）10μl；繼續(xù)孵育4h后加入溶解劑10%SDS，1%HCL（1mol/L），每孔100μl，37℃孵育，6h后在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度（570nm）值，并計(jì)算相對(duì)增殖率。

1.2.6 RT-PCR方法檢測(cè)rAAV2-IL-32感染KFs后的Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達(dá)：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收獲1×105細(xì)胞，離心沉淀，提取總RNA，按照試劑盒說明書作逆轉(zhuǎn)錄。用IL-32的引物做PCR檢測(cè)，PCR的反應(yīng)條件為：94℃ 4min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)rAAV2-IL-32感染KFs后的Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達(dá)：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入裂解緩沖液，冰上放置30min。然后在4℃、15 000×g離心15min，收集樣品并與上樣緩沖液一起煮沸10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；再將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗室溫孵育2h，TBST緩沖液洗3次，再加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育1h，ECL發(fā)光液作用1min后以化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行定量分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；兩組間差異比較用t檢驗(yàn)，三組間差異比較用方差分析和q檢驗(yàn)。P>0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 重組腺相關(guān)病毒載體rAAV2-IL-32的病毒滴度測(cè)定（表1），病毒滴度為 5.2×1011 v.g./ml。

2.2IL-32在KFs中的表達(dá)

2.2.1rAAV2-IL-32感染KFs后的熒光表達(dá)：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，rAAV2-IL-32在感染復(fù)數(shù)（MOI）105時(shí)感染效率達(dá)50%以上（圖2、3）。說明重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染成功，感染效率達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.2RT-PCR結(jié)果：rAAV2-IL-32感染KFs經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證在570bp處出現(xiàn)高表達(dá)電泳條帶，而腺相關(guān)病毒空載體組則未出現(xiàn)電泳條帶，表明rAAV2-IL-32在KFs中過表達(dá)（圖4）。

2.3 rAAV2-IL-32對(duì)KFs增殖能力的影響：腺相關(guān)病毒空載體和rAAV2-IL-32按照不同的感染復(fù)數(shù)濃度感染KFs，72h后，用MTT檢測(cè)方法分析KFs相對(duì)增殖率（圖5）。結(jié)果顯示：rAAV2-IL-32組比對(duì)照組細(xì)胞增殖率差異有顯著性（P<0.05），表明體外轉(zhuǎn)染IL-32基因后可抑制KFs生長(zhǎng)，且有濃度依賴性。

2.4 RT-PCR方法檢測(cè)rAAV2-IL-32感染KFs后Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達(dá)（表2）。

2.4.1Bcl-2、TGF-β1的表達(dá)結(jié)果：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，結(jié)果顯示： Bcl-2、TGF-β1在KF組的表達(dá)水平明顯高于正常皮膚組（P<0.05）；Bcl-2、TGF-β1在KF-IL-32組的表達(dá)水平明顯低于KF組和KF-EGFP組（P<0.05），說明體外感染rAAV2-IL-32 能顯著降低Bcl-2、TGF-β1在KFs中的表達(dá)水平。

2.4.2BAX的表達(dá)結(jié)果：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，結(jié)果顯示：BAX在KF組的表達(dá)水平明顯低于正常皮膚組（P<0.05）；BAX在KF-IL-32組的表達(dá)水平明顯高于KF組和KF-EGFP組（P<0.05），說明體外感染rAAV2-IL-32能顯著升高BAX在KFs中的表達(dá)水平。

2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)rAAV2-IL-32感染KFs后Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達(dá)：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示Bcl-2、TGF-β1的表達(dá)水平降低，BAX的表達(dá)升高（圖6），表明體外感染rAAV2-IL-32可上調(diào)BAX蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2、TGF-β1蛋白的表達(dá)。

3討論

近來許多研究表明，瘢痕疙瘩的形成可能與基因的結(jié)構(gòu)、功能或表達(dá)異常有關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制尚不明確。瘢痕疙瘩在臨床表現(xiàn)及組織病理學(xué)改變等方面與良性腫瘤有某些相似之處，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)基因及細(xì)胞因子在瘢痕疙瘩與正常皮膚中存在表達(dá)差異[6]，它們?cè)隈：鄹泶竦陌l(fā)生發(fā)展中起著重要作用。人IL-32基因定位于染色體16p13.3上，含有8個(gè)小外顯子，跨長(zhǎng)約5kb。人IL-32 mRNA長(zhǎng)為1.2kb，在免疫組織中表達(dá)增強(qiáng)[7]。目前發(fā)現(xiàn)，IL-32一共有6種剪接變異體[11]：IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε和IL-32ζ蛋白。IL-32的主要生物學(xué)功能：①誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子[4]；②是重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的基因：在T細(xì)胞中，IL-32的大量表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]；③在自身免疫性、炎癥性疾病里起重要作用[9]：IL-32可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)與多種炎癥性疾病密切相關(guān)；是一種前炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子，與疾病的嚴(yán)重性程度相關(guān)，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答和固有性免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。

在瘢痕疙瘩組織中及體外培養(yǎng)的KFs中均發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞增殖調(diào)控及細(xì)胞凋亡方面的異常。研究顯示凋亡相關(guān)基因的表達(dá)異常與瘢痕疙瘩的形成相關(guān)[10]。本課題組前期研究結(jié)果提示人IL-24基因在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)低下[11]。本研究發(fā)現(xiàn)人IL-32基因調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制與IL-24基因（腫瘤抑制基因）具有一致性，提示IL-32基因可作為病理性瘢痕基因治療的有效候選靶基因之一。

原癌基因Bcl-2有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用，TGF-β1可促進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖與分化，從而參與病理性瘢痕的形成。與其相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BAX則可促進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)成功將人IL-32基因腺相關(guān)病毒載體導(dǎo)入到人KFs中，通過RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)顯示：Bcl-2、TGF-β1在KF組的表達(dá)水平高于正常皮膚組；BAX的表達(dá)水平低于正常皮膚組。而Bcl-2、TGF-β1在KF-IL-32組的表達(dá)水平明顯低于KF組和KF- EGFP組；BAX在KF-IL-32組的表達(dá)水平高于KF組和KF- EGFP組。提示IL-32在mRNA和蛋白水平通過抑制Bcl-2、TGF-β1的表達(dá)或者同時(shí)提高BAX表達(dá)從而抑制瘢痕的增生。這有可能是IL-32基因抑制瘢痕疙瘩增生的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)僅研究了IL-32基因在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)KFs部分細(xì)胞因子間的相互作用。而IL-32基因與其他細(xì)胞因子間的作用以及通過何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響瘢痕凋亡，還有待進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2012-09-21 [修回日期]2011-11-03

編輯/張惠娟