張建軍　陳發(fā)國(guó)　吳毅平

[摘要]目的：探討氨甲喋呤對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響。方法：以體外培養(yǎng)的人瘢痕成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢奔奏┻剩?0-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L）加入細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行干預(yù)并與空白對(duì)照組比較，用乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒性，并通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和羥脯氨酸測(cè)定實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)藥物對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性和膠原合成的影響。結(jié)果：10-6mol/L、10-5mol/L的氨甲喋呤對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，與對(duì)照組比較差異有顯著性（P<0.01），10-9mol/L～10-5mol/L的氨甲喋呤對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞膠原合成具有抑制作用（P<0.01）。結(jié)論：氨甲喋呤在體外對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和膠原合成具有抑制作用。

[關(guān)鍵詞]氨甲喋呤；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；膠原合成

[中圖分類號(hào)]R619+.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）11-1961-03

增生性瘢痕是多種致傷因素對(duì)真皮組織作用后創(chuàng)面異常愈合的不良結(jié)局，不僅可伴有疼痛、瘙癢等不適癥狀，過(guò)度的增生還可以造成機(jī)體外形改變和功能障礙，進(jìn)而影響患者的生活質(zhì)量，對(duì)患者生理和心理造成損害，臨床治療效果目前多不令人滿意[1]，如何防治瘢痕的形成，一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。病理性瘢痕的形成機(jī)制異常復(fù)雜，已有的研究提示[2]：它是一個(gè)多種因素作用下的纖維化過(guò)程，其中（?。┏衫w維細(xì)胞的異常增殖以及其膠原的過(guò)度合成在其中發(fā)揮了重要的作用，已成為人們選擇治療的重要靶點(diǎn)。因此，從抑制成纖維細(xì)胞增殖和膠原代謝的方面尋找治療和預(yù)防瘢痕增生藥物具有重要意義。氨甲喋呤具有抗增殖和免疫抑制的雙重藥理作用，在對(duì)纖維化皮膚病諸如侵襲性纖維瘤[3]的治療中也發(fā)揮了一定的治療作用。我們通過(guò)以體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察氨甲喋呤對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響，為探討氨甲喋呤在治療增生性瘢痕方面的臨床應(yīng)用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物：氨甲喋呤：DMEM溶解后濾過(guò)除菌（0.2μm濾膜），配制成10-3mol/L濃度母液，置-20℃冰箱避光保存，貯存?zhèn)溆?。臨用時(shí)用無(wú)血清DMEM分別稀釋成0、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L[4]。

1.1.2主要儀器和試劑：DMEM：美國(guó)Gibco公司；MTT、胰蛋白酶：華美公司；小牛血清：浙江三立公司；DMSO上海Sangon公司；羥脯氨酸試劑盒：南京建成生物制品有限公司。OLYMPUS-IX71型倒置相差顯微鏡（日本）、Form Scientific CO2孵箱（美國(guó)）、BIO-RAD550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)）、HITACHI7176S型全自動(dòng)生化分析儀（日本）、TU-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

1.1.3標(biāo)本來(lái)源：增生性瘢痕成纖維細(xì)胞來(lái)源于手術(shù)中切下的增生性瘢痕，共3例（女2，男1）， 年齡1～25歲，取材部位分別為手部、頸部、髂腰部，病程分別為10個(gè)月、12個(gè)月、13個(gè)月，近期無(wú)使用瘢痕治療藥物史，不伴有腫瘤或其它嚴(yán)重疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：用組織塊法[5]進(jìn)行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：無(wú)菌條件下進(jìn)行漂洗、剪碎，接種于含10%新生牛血清（NCS）的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊中長(zhǎng)出并接近融合成單層時(shí)用0.125% 胰蛋白酶消化， 1： 2 傳代。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為4～6代。實(shí)驗(yàn)按照藥物濃度分為空白對(duì)照組0（為不含藥物的DMEM培養(yǎng)液）和實(shí)驗(yàn)組：10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L。

1.2.2 乳酸脫氫酶（LDH） 的測(cè)定：取4～8代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10%NCS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104/ml，用24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔接種1ml即2.5×104個(gè)細(xì)胞，置CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h，每一藥物濃度組及相應(yīng)對(duì)照組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，按實(shí)驗(yàn)藥物分組加入條件培養(yǎng)液1ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取上清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定LDH活性值。

1.2.3 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖狀況：MTT法參照Hansen[6]的方法略作修改，取4～8代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10%NCS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，用96孔板培養(yǎng)，每孔加入100μl即5×103個(gè)細(xì)胞，置CO2孵箱中培養(yǎng)24h，吸棄上清，每一藥物濃度組及相應(yīng)對(duì)照組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔，2個(gè)無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔，按實(shí)驗(yàn)藥物分組加入條件培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)24h，吸棄上清10μl加入MTT液10μl/孔（MTT5g/L）繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入DMSO100μl，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定吸光度A（波長(zhǎng)570nm）。

1.2.4 細(xì)胞分泌膠原含量的測(cè)定[7]：將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度5×104/ml，每孔加入1ml培養(yǎng)基，接種48h后更換條件培養(yǎng)液，每一藥物濃度組設(shè)計(jì)6個(gè)復(fù)孔。藥物作用48h，從每孔各吸取0.5ml培養(yǎng)基，按羥脯氨酸（HPr）檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，測(cè)定培養(yǎng)基中HPr含量。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)550 nm檢測(cè)培養(yǎng)基中A值，測(cè)定HPr的含量，樣品中HPr的質(zhì)量濃度（μg/ml）=（（測(cè)定管A值-空白管A值）/（標(biāo)準(zhǔn)液A值-空白管A值））×標(biāo)準(zhǔn)管質(zhì)量濃度（2μg/ml）；樣品中膠原的濃度（μg/ml培養(yǎng)基）=樣品中羥脯氨酸濃度×7.46×稀釋倍數(shù)（7.46是從羥脯氨酸換算為膠原時(shí)的計(jì)算常數(shù)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與同一對(duì)照組的比較的方差分析，數(shù)據(jù)用x±s表示，P<0.05示差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用：氨甲喋呤作用24h后，10-9mol/L、10-8mol/L濃度氨甲喋呤培養(yǎng)上清中LDH活性與對(duì)照組比較差異均無(wú)顯著性（P>0.05）；而10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L濃度氨甲喋呤與空白對(duì)照組比較，結(jié)果差異均有顯著性 （P<0.01）（見(jiàn)表1）。提示：高于10-7mol/L濃度的氨甲喋呤均表現(xiàn)出對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

2.2 藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響：10-6mol/L、10-5mol/L濃度氨甲喋呤藥物組分別與空白對(duì)照組比較差異均有顯著性（P=0.000），而10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L濃度氨甲喋呤藥物組分別與對(duì)照組比較差異均無(wú)顯著性（P>0.05）（見(jiàn)表2）。提示：高于10-6mol/L濃度的氨甲喋呤能顯著抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，而低于10-6mol/L濃度的氨甲喋呤卻未表現(xiàn)出此抑制作用。

2.3 藥物對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞膠原合成的影響：各濃度氨甲喋呤藥物組與空白對(duì)照組之間差異均有顯著性（P<0.01）（見(jiàn)表3）。提示：10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L濃度的氨甲喋呤均抑制了增生性瘢痕成纖維細(xì)胞膠原蛋白的合成。

3 討論

成纖維細(xì)胞在瘢痕形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，它是形成肉芽組織、合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)、進(jìn)行傷口重塑的重要細(xì)胞[2，8]，成纖維細(xì)胞的異常增殖和過(guò)度合成或分泌膠原蛋白的功能受到普遍關(guān)注。

氨甲喋呤對(duì)增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞是否有直接作用，目前還尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道。MTT法是目前常用的檢測(cè)細(xì)胞增殖和活力的方法，可以通過(guò)吸光度值的高低反映活性細(xì)胞的濃度。本試驗(yàn)MTT比色法結(jié)果顯示10-6mol/L、10-5mol/L濃度藥物組的吸光度值較對(duì)照組有一定程度的下降，與對(duì)照組有顯著性差異（P<0.01），提示10-6mol/L、10-5mol/L濃度的氨甲喋呤對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，這與安振梅報(bào)道的氨甲喋呤對(duì)人眼球后成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果基本一致[9]。

乳酸脫氫酶是所有細(xì)胞的胞漿內(nèi)均存在的細(xì)胞內(nèi)酶，細(xì)胞膜受損時(shí)可迅速釋放到細(xì)胞外，故可作為細(xì)胞毒性檢測(cè)的一項(xiàng)敏感指標(biāo)。我們測(cè)定了細(xì)胞上清液中的LDH值，結(jié)果氨甲喋呤作用24h后，10-9mol/L、10-8mol/L濃度氨甲喋呤培養(yǎng)上清中LDH活性與對(duì)照組比較差異均無(wú)顯著性（P>0.05）；而10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L濃度氨甲喋呤與空白對(duì)照組比較，結(jié)果差異均有顯著性（P<0.01）（見(jiàn)表1）。提示：高于10-7mol/L濃度的氨甲喋呤均可能損傷了部分瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜，而表現(xiàn)出其細(xì)胞毒性作用。

羥脯氨酸是膠原蛋白中特有的氨基酸，含量相對(duì)恒定，占膠原中總氨基酸的13.4%，而一般蛋白質(zhì)含量極微，故羥脯氨酸的測(cè)定值可間接反映膠原蛋白的合成情況。我們的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞上清液[7]中的羥脯氨酸的含量，結(jié)果顯示：在本實(shí)驗(yàn)條件下，10-9mol/L～10-5mol/L濃度的氨甲喋呤可使細(xì)胞上清液中的羥脯氨酸含量顯著降低（P<0.01），據(jù)此計(jì)算出的膠原蛋白含量，與對(duì)照組相比呈顯著性降低（P<0.01），這間接反映出對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的膠原合成的抑制作用。另外，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中10-9mol/L～10-7mol/L濃度的氨甲喋呤雖然并未表現(xiàn)出對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制作用，但卻抑制了膠原的合成，也提示氨甲喋呤可能存在的臨床應(yīng)用前景。

氨甲喋呤是一種有效的抗腫瘤藥物，它是二氫葉酸還原酶抑制劑，可阻止二氫葉酸向四氫葉酸轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞DNA合成障礙，干擾RNA和蛋白質(zhì)的生物合成，其主要作用于S期細(xì)胞，尤其對(duì)于處于對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞作用最強(qiáng)，我們選取的瘢痕成纖維細(xì)胞處于增殖旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，體外實(shí)驗(yàn)中氨甲喋呤對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成的抑制作用機(jī)制可能與此有關(guān)。另外，氨甲喋呤對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控也可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用[4]，我們通過(guò)MTT、LDH測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)合顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，10-6mol/L、10-5mol/L濃度的氨甲喋呤影響了細(xì)胞的活性，對(duì)部分細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生了損傷，但這部分成纖維細(xì)胞究竟是發(fā)生了壞死還是凋亡目前還不清楚，需要通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。

氨甲喋呤被用于兒童并指畸形術(shù)后瘢痕疙瘩的預(yù)防和治療，療效滿意[10]，但未見(jiàn)到氨甲喋呤治療增生性瘢痕的報(bào)道。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，氨甲喋呤雖然在體外可抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成，臨床治療瘢痕疙瘩也發(fā)揮了治療作用，但其潛在的治療增生性瘢痕的作用可能會(huì)由于它的細(xì)胞毒性作用而受到一定的限制。

氨甲喋呤作為一種免疫抑制劑，臨床用于治療硬皮病[3，11]、難治性的牛皮癬、結(jié)節(jié)病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[12]。瘢痕增生過(guò)程中局部免疫反應(yīng)活躍，氨甲喋呤是否可通過(guò)抑制局部增強(qiáng)的免疫反應(yīng)來(lái)間接調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，促進(jìn)瘢痕的消退，需要今后的實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氨甲喋呤一方面可直接抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，另一方面可減少膠原蛋白的生成。因此可以推測(cè)該藥在防治增生性瘢痕方面可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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[收稿日期]2012-07-26[修回日期]2012-10-15

編輯/張惠娟