梅基雄 張麗艷 謝宇 劉冬蘭 唐靖雯

1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002;2.貴州威門(mén)股份有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550002

川芎茶調(diào)顆粒原方出自于宋《太平惠民和劑局方》。方中由川芎、白芷、羌活、細(xì)辛、防風(fēng) 、薄荷、荊芥和甘草等幾味中藥組成。該制劑疏風(fēng)止疼，主治風(fēng)邪頭痛，或有惡寒，發(fā)熱，鼻塞。臨床上常應(yīng)用于外感風(fēng)邪引起的感冒頭痛也可用偏頭痛、神經(jīng)性頭痛或外傷后遺癥所致的頭痛［1］，也有結(jié)合其他藥物治療鼻炎的報(bào)道［2］。川芎茶調(diào)顆粒為“國(guó)家基本藥品目錄”收載品種。

目前，川芎茶調(diào)顆粒未見(jiàn)指紋圖譜方面的研究報(bào)道，川芎茶調(diào)顆粒的質(zhì)量控制方面的研究文獻(xiàn)報(bào)道也較匱乏。因中藥指紋圖譜技術(shù)現(xiàn)已成為評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的有效手段［3］。本文通過(guò)建立川芎茶調(diào)顆粒HPLC指紋圖譜，對(duì)川芎茶調(diào)顆粒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為川芎茶調(diào)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供研究依據(jù)。

1 儀器及試劑

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀 (四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器、Chemstation色譜工作站)，80－2臺(tái)式低速離心機(jī)，AG135型電子天平 (梅特勒－托利多公司)，中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系 (2004A版)。

1.2 試藥 甘草酸銨 (購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110731－201116);乙腈 (色譜純，美國(guó)TEDIA);正丁醇 (分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司);甲醇 (分析純，上海振興化工一廠);娃哈哈純凈水 (杭州娃哈哈集團(tuán))，其余試劑均為分析純。供試品有貴州威門(mén)藥業(yè)提供，批次見(jiàn)表1。

表1 10批次川芎茶調(diào)顆粒批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonisil(R)鉆石C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:A:乙腈，B:0.05%甲酸溶液，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1;檢測(cè)波長(zhǎng):254nm;流速:1ml/min;柱溫:20℃。

表2 洗脫程序表

2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取樣品5g，研細(xì)，精密加入25ml50%乙醇溶液，加熱回流30分鐘，放冷，補(bǔ)重，搖勻，離心10分鐘 (4000轉(zhuǎn)/分鐘)，吸取上清液10ml置蒸發(fā)皿中，蒸干，用5ml水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，分次用水飽和正丁醇萃取三次，每次25ml，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70%甲醇溶解，定容至5ml，搖勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取阿魏酸對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每1ml含0.5mg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一批次供試品溶液20μL，按照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值基本一致，RSD均小于3%，在同一臺(tái)儀器上相似度均大于0.99，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批次供試品溶液20μL，按照上述色譜條件，分別于0、6、12、18、24、36、48h測(cè)定，記錄色譜圖。各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值基本一致，RSD均小于3%，在同一臺(tái)儀器上相似度均大于0.99，符合指紋圖譜技術(shù)要求，結(jié)果表明，供試品溶液在48 h內(nèi)樣品溶液的成分穩(wěn)定。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 分別精密量取同一樣品6份，按供試品溶液方法制備，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值基本一致，RSD均小于3%，在同一臺(tái)儀器上相似度均大于0.99，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.6 指紋圖譜的建立 分別取10批次的川芎茶調(diào)顆粒，按供試品溶液方法制備，精密吸取供試品溶液20ul注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄135min的色譜圖。

2.7 指紋圖譜的分析

2.7.1 共有峰的標(biāo)定 比較10批次樣品的色譜圖，標(biāo)定22個(gè)色譜峰為共有峰，見(jiàn)圖1。其中20號(hào)峰為川芎茶調(diào)顆粒顆粒指標(biāo)性成分甘草酸銨峰，該峰吸收強(qiáng)，峰面積大，故選此峰作為參考峰。共有峰相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表3，共有峰相對(duì)峰面積見(jiàn)表4。

表3 10批川芎茶調(diào)顆粒共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4 10批川芎茶調(diào)顆粒共有峰的相對(duì)峰面積

共有峰81 0.191 0.170 6 0.133 0.120 0.109 0.132 0.113 0.113 0.119 0.155 0.215 0.201 7 0.140 0.092 0.077 0.085 0.168 0.078 0.104 0.106 0.123 0.107 8 0.226 0.202 0.192 0.172 0.202 0.191 0.208 0.214 0.27 0.245 9 0.489 0.199 0.178 0.340 0.229 0.156 0.184 0.266 0.399 0.320 10 0.296 0.254 0.231 0.206 0.272 0.235 0.291 0.296 0.364 0.257 11 0.379 0.309 0.279 0.342 0.406 0.314 0.413 0.496 0.629 0.559 12 0.327 0.382 0.291 0.245 0.361 0.331 0.345 0.308 0.654 0.567 13 0.392 0.295 0.256 0.255 0.373 0.268 0.372 0.546 0.889 0.767 14 0.101 0.083 0.056 0.072 0.092 0.065 0.114 0.103 0.144 0.121 15 0.066 0.055 0.051 0.068 0.056 0.065 0.105 0.084 0.103 0.100 16 0.120 0.107 0.075 0.112 0.114 0.087 0.166 0.149 0.201 0.169 17 0.073 0.060 0.037 0.161 0.204 0.040 0.151 0.055 0.070 0.060 18 0.149 0.137 0.121 0.109 0.120 0.076 0.197 0.168 0.119 0.197 19 0.087 0.083 0.085 0.100 0.106 0.090 0.106 0.091 0.095 0.090 20(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 21 0.114 0.111 0.073 0.096 0.125 0.15 0.124 0.099 0.106 0.065 22 0.150 0.152 0.163 0.156 0.179 0.179 0.191 0.S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 5 0.077 0.068 0.069 0.090 0.073 0.066 0.072 0.0 138 0.121 0.143

2.7.2 相似度評(píng)價(jià) 應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系 (2004A版)計(jì)算10批樣品的相似度，評(píng)價(jià)其色譜峰相似度的一致性，10批次相似度均大于0.9，10批次川芎茶調(diào)顆粒指紋圖譜結(jié)果見(jiàn)圖2，相似度結(jié)果見(jiàn)表3。

表5 10批次川芎茶調(diào)顆粒相似度

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、50%甲醇、70%甲醇以及100%甲醇的提取溶劑的提取效率，結(jié)果50%乙醇提取出峰數(shù)量多，吸收較強(qiáng)，故選擇作為提取溶劑?；亓魈崛∨c超聲提取的效率基本相同，但回流提取的譜圖中某些峰的響應(yīng)值略高，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，回流提取的樣品較穩(wěn)定，故選擇回流提取為本實(shí)驗(yàn)的提取方法?？疾觳煌ㄩL(zhǎng)下的指紋圖譜，在254nm處出峰數(shù)多，分離度高，故選擇254nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.05%甲酸、甲醇 －0.02%磷酸、乙腈 －0.02%磷酸、乙腈 －0.02%磷酸、乙腈－0.02%三乙胺，結(jié)果顯示在乙腈－0.05%甲酸 (梯度洗脫)流動(dòng)相條件下，柱效較高，出峰均勻。色譜圖中各個(gè)色譜峰分離度較好，且基線平穩(wěn)，故選擇乙腈－0.05%甲酸為流動(dòng)相系統(tǒng)。

通過(guò)10批次川芎茶調(diào)顆粒指紋圖譜可以看出，其相似度均大于0.9，證明同一廠家生產(chǎn)的川芎茶調(diào)顆粒質(zhì)量穩(wěn)定，為川芎茶調(diào)顆粒質(zhì)量控制水平的提升奠定一定的研究基礎(chǔ)。

［1］林曉蘭.川芎茶調(diào)顆粒臨床應(yīng)用情況分析［J］.北京中醫(yī)，2004，23(3):90－192.

［2］朱優(yōu)立，王琳，馬崧.川芎茶調(diào)顆粒沖劑治療急性鼻竇炎的臨床觀察［J］.實(shí)用診斷與治療雜志，2005，19(9):69.

［3］羅國(guó)安，梁瓊麟，王義明.中藥指紋圖譜［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2009:1.