王澤慧，邊云飛，肖傳實

血管平滑肌細胞（VSMC）的異常增殖是高血壓血管重構(gòu)以及血管增殖性疾病，如動脈粥樣硬化、經(jīng)皮腔冠狀動脈介入治療術(shù)（PCI）后再狹窄、血管移植術(shù)后新生內(nèi)膜增生等發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)。

microRNA可以調(diào)節(jié)多種基因的表達。近年來發(fā)現(xiàn)miR－145是正常動脈中含量最豐富的miRNA，且主要聚集在VSMC［1］。miR－145在原代培養(yǎng)的VSMC中含量最豐富而在去分化的VSMC中的表達是下調(diào)的［2］。本實驗室前期已經(jīng)成功構(gòu)建了大鼠miR－145重組慢病毒載體并在去分化型VSMC中過表達，但是miR－145是否能抑制去分化型VSMC增殖及其機制仍不清楚。故本實驗以體外培養(yǎng)的大鼠原代VSMC為模型，應(yīng)用PDGF－BB作為外界刺激因子誘導VSMC增殖，同時用構(gòu)建好的大鼠miR－145重組慢病毒載體浸染目的細胞，CCK－8法檢測細胞增殖情況，并在分子水平探討miR－145是否通過抑制PDGF激活MAPK途徑從而抑制VSMC增殖，從而為其抑制VSMC增殖的作用機制提供新的思路及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供健康SD大鼠，體重110g～130g；DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司；PDGF－BB購自美國PEPROTECH公司；CCK－8試劑購自碧云天公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT－PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；引物設(shè)計與合成由上海吉瑪公司完成；蛋白提取試劑盒購自北京普利萊公司；PVDF膜購自北京索萊寶公司；磷酸化ERK1／2和總ERK1／2抗體購自北京博奧森公司；磷酸化JNK和總JNK抗體、磷酸化p38MAPK和總p38MAPK抗體均購自美國Cell signaling technology公司；羊抗兔二抗購自Santa公司；marker購自富酶泰斯生物技術(shù)（深圳）有限公司；Ecl－plus發(fā)光試劑盒購自武漢博士德公司；其他試劑均系進口或國產(chǎn)分析純。

1．2 方法

1．2．1 大鼠原代VSMC培養(yǎng) 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMC，傳代后對VSMC進行抗αSM－actin免疫細胞化學染色鑒定。選擇3～8代進行實驗。

1．2．2 實驗分組 將細胞分為4組?？瞻讓φ战M：培養(yǎng)的大鼠原代VSMC不做任何處理。PDGF－BB組：大鼠原代VSMC中加 入 終 濃 度 為 10g／mLPDGF－BB。PDGF－BB＋ miR－145組：細胞轉(zhuǎn)染miR－1 4 5慢病毒載體7 2h后加入終濃度為1 0 g／mLDGF－BB。miR－NC組：細胞轉(zhuǎn)染陰性慢病毒載體。

1．2．3 CCK－8法測細胞增殖 收集對數(shù)期細胞種96孔板，每孔加入100μL細胞，邊緣孔用無菌PBS填充，加入各組中的藥物及慢病毒，每孔100μL，每組設(shè)5個復(fù)孔。5%CO2，37℃孵育48h。每孔加入10μLCCK－8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1h～4h。酶標儀在450nm波長處測每孔的光密度值。

1．2．4 細胞RNA提取和RT－PCR反應(yīng) 使用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到對應(yīng)細胞的cDNA模板，采用SYBR Green法進行Real－time PCR檢測，反應(yīng)體系為20 μL，包含上下游引物、DNA 模板、Taq DNA polymerase和ddH2O。定量反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火31s，進行40個循環(huán)。各組PCR均重復(fù)3次。使用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。mRNA的相對表達量用2－△△Ct方法來表示，其中△Ct＝Ct目標mRNA－CtGAPDH，△△Ct＝△Ct處理－△Ct對照。

1．2．5 Western印跡方法檢測 ERK1／2 和 p－ERK1／2等的表達 用Bradford法測蛋白濃度。5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜（PVDF膜），依次加入兔抗鼠ERK1／2和p－ERK1／2抗體（1∶2 00）、兔抗鼠JNK和p－JNK抗體（1∶2 000）、兔抗鼠p38MAPK和p－p38MAPK（1∶2 000）浸泡濾膜，4℃過夜，洗滌后加入堿磷酶標記的羊抗兔IgG（1∶3 000），洗膜后ECL化學發(fā)光試劑檢測。定量分析采用分子生物學圖像分析系統(tǒng)。

1．3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13．0軟件，用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2．1 miR－145對PDGF誘導VSMC增殖的影響 CCK－8結(jié)果顯示，與空白對照組比較，miR－NC組OD值無統(tǒng)計學意義；PDGF組OD值明顯升高（P＜0．05），PDGF可促進VSMC增殖。與PDGF－BB組比較，PDGF－BB＋miR－145組OD值明顯下降（P＜0．05），提示miR－145可抑制PDGF誘導的VSMC增殖。詳見表1。

表1 miR－145對VSMC增殖影響的CCK－8結(jié)果（±s）

表1 miR－145對VSMC增殖影響的CCK－8結(jié)果（±s）

組別 CCK－8（OD）空白組0．855±0．062 miR－NC組 0．777±0．058 PDGF－BB＋miR－145組 0．545±0．0351）PDGF－BB組 1．374±0．0861）2）與空白組比較，1）P＜0．05；與PDGF－BB＋miR－145組相比，2）P＜0．05

2．2 miR－145對VSMC相關(guān)基因的影響 RT－PCR結(jié)果顯示：與空白對照組比較，miR－NC組PCNA、c－Jun及SM22amRNA的表達無統(tǒng)計學意義，PDGF組PCNA、c－Jun mRNA的表達分別上調(diào)1．37倍和2．68倍（P＜0．05），而SM22amRNA的表達下調(diào)80%（P＜0．05）。提示PDGF可促進 VSMC增殖抑制VSMC分化；與 PDGF－BB組比較，PDGF－BB＋miR－145組 PCNA、c－Jun mRNA 的表達分別下調(diào)66．4%和77．2%（P＜0．05），而SM22amRNA 的表達上調(diào)4．4倍（P＜0．05）。提示miR－145可抑制PDGF誘導的VSMC增殖而促進VSMC分化。

2．3 miR－145對PDGF誘導的p－ERK／ERK 蛋白表達的影響

Western－blot結(jié)果顯示：PDGF－BB（10ng／mL）誘導 VSMC后，p－ERK水平明顯上調(diào)，與對照組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。轉(zhuǎn)染 miR－145干預(yù)72h后再加入 PDGF－BB刺激，p－ERK水平明顯下調(diào)，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）?？召|(zhì)粒組與對照組相比無統(tǒng)計學意義。詳見圖1。

圖1 miR－145對PDGF誘導的p－ERK／ERK蛋白表達的影響

2．4 miR－145對PDGF誘導的p－JNK／JNK蛋白表達的影響Western－blot結(jié)果顯示：PDGF－BB（10ng／mL）誘導 VSMC后，p－JNK水平明顯上調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。轉(zhuǎn)染 miR－145干預(yù)72h后再加入PDGF－BB刺激，p－JNK 水平明顯下調(diào)，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）?？召|(zhì)粒組與對照組相比無統(tǒng)計學意義。詳見圖2。

圖2 miR－145對PDGF誘導的p－JNK／JNK蛋白表達的影響

2．5 miR－145對 PDGF 誘導的 p－p38MAPK／p38MAPK 蛋白 表 達 的 影 響 Western－blot結(jié) 果 顯 示 ：PDGF－BB（1 0 ng／mL）誘導VSMC后，p－p38MAPK水平明顯上調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。轉(zhuǎn)染miR－145干預(yù)72h后再加入PDGF－BB刺激，p－p38MAPK水平明顯下調(diào)，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）?？召|(zhì)粒組與對照組相比無統(tǒng)計學意義。詳見圖3。

圖3 miR－145對PDGF誘導的p－p38MAPK／p38MAPK蛋白表達的影響

3 討 論

VSMC由分化表型向去分化表型轉(zhuǎn)化是VSMC增殖與遷移的關(guān)鍵性起始步驟，這是許多血管增生性疾病如：動脈粥樣硬化、高血壓和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）術(shù)后再狹窄等疾病共同的細胞病理基礎(chǔ)之一。microRNA是近些年來研究的熱點之一，而miR－145受到關(guān)注是由于它在許多癌癥中的表達下調(diào)，能夠抑制癌細胞增殖，是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因［3，4］。然而，miR－145能否抑制VSMC的增殖仍不清楚。miR－145是VSMC一個重要的表性標記物和表型調(diào)節(jié)劑，能夠抑制新生內(nèi)膜的形成［1］。但是抑制新生內(nèi)膜形成的具體機制尚未闡明。因此，進一步研究miR－145抑制VSMC增殖的機制是本次研究的重點。

細胞增殖是一系列基因有序調(diào)控的結(jié)果，在許多病理情況下，外界環(huán)境造成某些生長因子（如PDGF）增多，通過刺激信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)某些基因表達增多，使VSMC的增殖失控，引起一系列病理改變［5］。MAPK是刺激脊柱類動物細胞增殖、分化的信號在細胞內(nèi)傳遞的交匯點或共同通路［6，7］。PDGF能夠吸引血管中層平滑肌向內(nèi)膜下遷移，使VSMC從收縮型變?yōu)楹铣尚?，合成型（即去分化型）VSMC有很強的增殖能力及更高的MAPK水平［8］。PDGF通過受體酪氨酸酶途徑激活靜止期VSMC的 MAPK［9］，MAPK 激活轉(zhuǎn)錄因子，增加 VSMC的DNA合成，促進細胞增殖［10］。miR－145能否通過抑制去分化型VSMC中的MAPK信號通路，進而抑制VSMC的增殖尚不清楚。本實驗測CCK－8比較PDGF組和轉(zhuǎn)染miR－145慢病毒載體再給PDGF組的VSMC增殖情況；RT－PCR說明miR－145抑制增殖的機制與VSMC相關(guān)基因的表達有關(guān)；同時做western blot說明miR－145抑制PDGF誘導的VSMC增殖的機制與其抑制MAPK通路中的p－ERK／ERK、p－JNK／JNK、p－p38MAPK／p38MAPK蛋白的表達有關(guān)。

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