李 娜，冶亞平，朱會芳，韓芳毅，千新來

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,河南新鄉(xiāng) 453003)

乳頭瘤病毒(human papillomaviruses，HPVs)是一組小分子雙鏈DNA病毒，研究證實高危型人乳頭瘤病毒(high risk-HPVs，hr-HPVs)特別是HPV16型與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展存在著密切關(guān)系，其與肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生與演進的關(guān)系也受到廣泛關(guān)注[1-2]。本研究以人低轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MCF-7為研究對象，通過脂質(zhì)體將HPV16 E6、E7和同時表達E6/E7的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MCF-7細胞，探討HPV16 E6、E7和E6/E7同時穩(wěn)定表達對HPV16陰性的乳腺癌細胞侵襲能力的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 (1)質(zhì)粒與細胞株：pcDNA3.1-E6、pcDNA3.1-E7和pcDNA3.1-E6/E7真核表達質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建并保存。人低轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞系MCF-7購于中科院上海細胞庫。(2)主要試劑：SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒、lipofectamineTM2000均為Invitrogen公司產(chǎn)品。羊抗HPV16 E6多克隆抗體(IgG)、鼠抗HPV16 E7單克隆抗體(IgG)為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。引物由上海生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染 細胞在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞長至70%融合時，按lipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染9 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，設(shè)置MCF-7-vect轉(zhuǎn)染組、MCF-7親本細胞組、轉(zhuǎn)基因組(MCF-7-E6細胞組，MCF-7-E7細胞組，MCF-7-E6/E7細胞組)。用G418(800 μg/mL)篩選陽性克隆。每種轉(zhuǎn)染細胞分別挑取4個單克隆培養(yǎng)擴增，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。

1.2.2Western blot檢測蛋白表達 按照試劑盒說明書提取細胞質(zhì)、細胞核蛋白，蛋白上清經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(5%濃縮膠，12%分離膠)后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，TBST封閉，一抗室溫搖育，TBST洗滌；二抗于室溫搖育，TBST洗滌，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育3～5 min，經(jīng)X線片曝光、顯影、定影。顯色結(jié)果用軟件Bandscan5.0進行灰度分析，并計算蛋白的相對表達水平。

表1 不同細胞克隆中HPV16 E6、E7蛋白的表達

1.2.3Transwell侵襲實驗和遷移實驗 加含10%FBS的完全培養(yǎng)基于24孔板(600 μL/孔)，小心取出小室放入24孔板中，膜上鋪人工基底膜Matrigal膠，靜置5 min。取單細胞懸液400 μL接種入小室，常規(guī)培養(yǎng)18 h。取出小室，結(jié)晶紫染色。通過倒置顯微鏡下計數(shù)6個視野穿膜細胞數(shù)，每組設(shè)3個平行樣本，共重復(fù)3次計算平均值。遷移實驗小室內(nèi)不鋪設(shè)基質(zhì)膠，余同侵襲實驗。

1.2.4RT-PCR法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrixmetallo proteinases-2，MMP-2) mRNA的表達 MMP-2上游引物序列：5′-TTC AAG GAC CGG TTC ATT TGG CGG ACT GTG-3′，下游引物序列：5′-TTC CAA ACT TCA CGC TCT TCA GAC TTT GGT T-3′，目的片段長度為493 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃×2 min、94 ℃×1 min、58 ℃×1 min和72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上成像及測定分析，實驗重復(fù)3次計算平均值。

2 結(jié) 果

2.1不同細胞克隆中HPV16 E6和E7蛋白的表達 MCF-7-vect和MCF-7親本細胞中HPV16 E6和E7蛋白表達均為陰性。MCF-7-E6的 1號克隆、MCF-7-E7的4號克隆和MCF-7-E6/E7的4號克隆分別穩(wěn)定高表達HPV16 E6、E7和同時穩(wěn)定高表達E6/E7，見表1。

2.2HPV16 E6和E7穩(wěn)定高表達對MCF-7細胞侵襲能力的影響 與MCF-7親本、MCF-7-vect和MCF-7-E7細胞比較，MCF-7-E6和MCF-7-E6/E7細胞穿膜細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，見表2，圖1。

表2 Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果

2.3HPV16 E6和E7穩(wěn)定高表達對MCF-7細胞MMP-2 mRNA表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示：在MCF-7-vect和MCF-7親本細胞中MMP-2 mRNA表達陰性，而在3種重組細胞中均有表達。半定量分析結(jié)果顯示，MMP-2 mRNA的相對表達量在MCF-7-E6、MCF-7-E7和MCF-7-E6/E7細胞組中分別為0.760±3.784、0.742±7.022和0.838±2.770，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

A：MCF-7親本細胞；B：MCF-7-vect細胞；C：MCF-7-E6細胞；D：MCF-7-E7細胞；E：MCF-7-E6/E7細胞

M：1 000 bp 標記物；1：MCF-7-E6細胞；2：MCF-7-E7 細胞；3：MCF-7-E6/E7 細胞；4：MCF-7-vect細胞；5：MCF-7 親本細胞

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)資料統(tǒng)計，發(fā)病率占全部惡性腫瘤的7%～10%。盡管目前對腫瘤的手術(shù)、化療和放療三位一體的綜合治療已取得了很大的進步，但仍約有50%的乳腺癌患者在治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗[1]。因此，闡明乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制以及尋找相應(yīng)的干預(yù)措施，已成為提高患者5年生存率所面臨的最大挑戰(zhàn)。

有研究顯示大約50%的乳腺癌患者伴有hr-HPVs的感染[2]。hr-HPVs感染在肺癌、食管癌、乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)生和演進中的作用也日益受到重視[3-6]。hr-HPVs特別是HPV16型與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展存在著密切的病因?qū)W關(guān)系[7-9]，其與頭頸部惡性腫瘤、肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生與演進的關(guān)系也受到廣泛關(guān)注。將HPV16 E6和E7基因轉(zhuǎn)染入無轉(zhuǎn)移能力的鼠源性永生化細胞后，可賦予該細胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力。這些結(jié)果均提示hr-HPVs與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移可能存在著密切的關(guān)系。但是關(guān)于HPV16 E6和E7在促腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用及其機制等問題仍不清楚。

人乳腺癌細胞系MCF-7是目前公認的具有低轉(zhuǎn)移特性的細胞系，并且已證實該細胞系HPV16陰性。因此，本研究以該細胞系為研究對象，建立了穩(wěn)定高表達HPV16 E6、E7和同時表達E6/E7的乳腺癌細胞株，并通過Transwell實驗進一步探討了HPV16 E6、E7和E6/E7對乳腺癌細胞侵襲能力的影響。通過RT-PCR方法探討HPV16 E6和E7對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2表達的影響。結(jié)果顯示：與MCF-7親本細胞和MCF-7-vect細胞比較，MCF-7-E6、MCF-7-E7和MCF-7-E6/E7細胞穿過基膜的細胞數(shù)目明顯增多，并且MMP-2 mRNA表達明顯增加。表明HPV16 E6和E7可能通過誘導(dǎo)MMP-2的表達而促進了MCF-7細胞的侵襲能力。有研究亦證實了HPV16 E6/E7可增強細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[1,10]。

另外，MCF-7-E6細胞、MCF-7-E7細胞和MCF-7-E6/E7細胞中，以MCF-7-E6細胞和MCF-7-E6/E7侵襲能力增強最為顯著，表明HPV16 E6可能在促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著更為重要的作用。其機制除促進MMP-2的表達之外還可能為：HPV16等hr-HPVs的E6蛋白可通過其C-端PDZ基序與調(diào)控細胞連接形成和細胞黏附等相關(guān)的PDZ蛋白相互作用，并誘導(dǎo)它們降解，從而引起腫瘤細胞間黏附性降低、失去接觸性抑制并有利于癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11-15]。

綜上所述，本研究初步證實了HPV16 E6和E7穩(wěn)定高表達可以誘導(dǎo)MMP-2的表達，并促進MCF-7細胞的侵襲能力。從而為設(shè)計新的、以HPV16 E6和E7為靶點的治療乳腺癌等HPVs相關(guān)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的方案提供重要的科學(xué)依據(jù)。

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