何一，王崇樹，魏壽江，王攀

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外科，四川 南充 637000)

SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤的建立和鑒定

何一，王崇樹△，魏壽江，王攀

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外科，四川 南充 637000)

目的:建立多藥耐藥人胃癌細胞裸鼠移植瘤模型并探討移植瘤的耐藥特性。方法:將人胃癌細胞株SGC-7901和耐藥細胞株SGC-7901/HCPT分別接種于裸小鼠左側背部皮下和右側背部皮下，在SPF級動物合格環(huán)境下飼養(yǎng)，觀察腫瘤細胞成瘤情況，用MTT法比較移植瘤細胞對羥基喜樹堿的敏感性及免疫組化測定其耐藥基因TOPO-Ⅰ表達的變化。結果:SGC-7901和SGC-7901/HCPT裸小鼠移植成瘤率為100%，無自行消退現(xiàn)象。MTT法測定SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分別為4.686 μg/mL和4.381 μg/mL，與移植前細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義。耐藥基因TOPO-Ⅰ表達分別為2.964±0.162和2.953±0.172，差異無著性意義。結論:以SGC-7901/HCPT細胞建立的裸鼠皮下耐藥移植瘤模型，仍保持體外的耐藥活性和基因表型，為耐藥機制和逆轉的研究提供了良好的動物模型。

胃腫瘤;腫瘤移植;動物

腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成腫瘤化療失敗的主要原因［1］。為此我們利用胃癌耐羥基喜樹堿細胞株SGC-7901/HCPT成功接種于裸小鼠，建立體內腫瘤耐藥模型并對其耐藥特性進行初步研究，為腫瘤耐藥機制研究和逆轉耐藥藥物的篩選提供一個體內模型。

1 材料和方法

1.1 細胞和動物

人胃癌細胞株SGC-7901由重慶醫(yī)科大學病理生理教研室惠贈，人胃癌耐羥基喜樹堿細胞株SGC-7901/HCPT由本課題組采用逐步增加藥物劑量的方法誘導建立［2］。常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞備用。BALB/C(nu，nu)裸小鼠購自重慶醫(yī)科大學動物實驗中心，雌雄皆用，4～5周齡，體重21～25 g，在SPF級動物合格環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 試劑

RPMI-1640干粉培養(yǎng)基:美國GIBICO公司生產(chǎn);小牛血清:成都哈里生物工程有限公司生產(chǎn);四甲基偶氮唑鹽(MTT):美國Sigma公司生產(chǎn);超凈工作臺:蘇凈集團安泰公司制造;二氧化碳孵育箱:美國Forma Scientific Inc生產(chǎn);倒置熒光顯微鏡:日本Olympus生產(chǎn);自動酶標讀數(shù)儀:日本Microplate header生產(chǎn);兔抗人TOPO-Ⅰ多克隆抗體購于博士德生物有限公司;免疫組化試劑盒和DAB試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 裸小鼠皮下移植瘤模型的建立

將親代SGC-7901接種于裸小鼠左側背部皮下，耐羥基喜樹堿細胞系SGC-7901/HCPT接種于裸小鼠的右側背部皮下，接種濃度均為1×107/mL，劑量為0.3 mL。接種第6～9天，可見裸小鼠接種部位長出腫塊，用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，按下面公式計算腫瘤體積:V=2/3×a×b。2周后，當包塊約1.0 cm大小，取出包塊，去除周圍纖維組織，用篩網(wǎng)法制備單細胞懸液，將其接種另一只裸小鼠的背部皮下，待腫瘤包塊長至約1.0 cm大小，取出，重復上述操作計4次。

1.4 細胞毒試驗(MTT)

在第四次腫瘤接種后3周處死裸小鼠，無菌條件下分離腫瘤組織，將新鮮瘤塊用篩網(wǎng)法制備成單細胞懸液并接種于培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)，將上述細胞和接種裸鼠前的細胞于指數(shù)增長期接種于96孔板，每孔含細胞104個，平行3孔，各孔定容200 μL/孔，實驗孔加羥基喜樹堿，wild SGC-7901和SGC-7901/nude分別加入A(0.1 μg/mL)、B(0.2 μg/mL)、C(0.4 μg/mL)、D(0.8 μg/mL)、E(1.6 μg/mL)五個濃度水平，每孔20 μL;wild SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nudeA分別加入(1 μg/mL)、B(2 μg/mL)、C(4 μg/mL)、D(8 μg/mL)、E(1.6 μg/mL)五個濃度水平。每孔20 μL，培養(yǎng)72 h，每孔加入MTT 20 μL(5 mg/L)，4 h后棄上清并加入DMOS(150 μL/孔)，充分振蕩10 min，使結晶顆粒溶解，用酶標儀在590 nm處測定吸光度值(A)，按公式計算細胞抑制率(抑制率=1－實驗組A值/對照組A值)。

1.5 免疫組化測定TOPO-Ⅰ表達情況

在第四次腫瘤接種后3周處死裸小鼠，無菌條件下分離腫瘤組織，將新鮮瘤塊用篩網(wǎng)法制備成單細胞懸液，制細胞爬片，行免疫組化(S-P)法檢測，按試劑盒說明操作。結果判斷:排除爬片邊緣細胞，10×10低倍鏡下隨機選取10個細胞分布視野，每個視野在10×20中倍鏡下記數(shù)50個細胞。根據(jù)細胞著色強弱分為四個等級，無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分［3］。按公式HSCORE=∑Pi(I+1)(i=0、1、2、3…;Pi表示評分為I的比例)計算HSCORE得分。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 初代移植和傳代成功率

SGC-7901和SGC-7901/HCPT兩株胃癌細胞分別接種裸鼠于裸小鼠左側背部皮下和右側背部皮下，在裸小鼠左側背部皮下和右側背部皮下可見到腫瘤結節(jié)形成，取出移植瘤進行傳代，移植成功率達到100%。尚未發(fā)現(xiàn)移植瘤有自發(fā)性消退現(xiàn)象。

2.2 裸小鼠移植瘤的耐藥特性

為了明確SGC-7901/HCPT裸小鼠移植瘤經(jīng)體外培養(yǎng)檢測是否仍保持對羥基喜樹堿耐藥的特性，取裸小鼠移植腫瘤組織無菌條件下制成分離細胞，與羥基喜樹堿對原代細胞的細胞毒作用進行比較，結果(表1)表明裸小鼠Wild SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分別為4.686 μg/mL和4.381 μg/mL，與移植前細胞比較，其差異無統(tǒng)計學意義。

表1 SGC-7901/HCPT/nude細胞與SGC-7901/nude細胞對HCPT的耐藥指數(shù)

2.3 裸小鼠移植瘤的耐藥表型

為了明確SGC-7901/HCPT裸小鼠移植瘤是否具有耐羥基喜樹堿的耐藥表型，對移植瘤腫瘤免疫組織化學染色檢測TOPO-Ⅰ表達水平，結果表明同移植前體外培養(yǎng)的Wild SGC-7901/HCPT細胞相比，SGC-7901/HCPT/nude細胞也具有TOPO-Ⅰ表達水平下降，其差異無統(tǒng)計學意義，表明SGC-7901/HCPT/nude仍保留耐羥基喜樹堿的基因表型，見表2。

表2 SGC-7901和SGC-7901/HCPT的TOPO-Ⅰ的表達情況

3 討論

體內建立耐藥動物模型，一般有移植耐藥細胞株瘤或腫瘤組織(移植型)和荷瘤動物給藥誘導耐藥(誘導型)兩種方式。由于荷瘤動物給藥誘導耐藥，操作復雜，時間長，受荷瘤動物生存時間的限制，應用較少，目前實驗研究多采用移植方式。實體瘤耐藥移植瘤模型多采用皮下移植和原位移植兩種途徑，通常認為原位移植優(yōu)于皮下移植模型，主要是由于能夠模擬體內的器官微環(huán)境，雖能更好的反映腫瘤的形態(tài)特點和生物學行為，但由于操作復雜，創(chuàng)傷性大，每次接種數(shù)量有限，腫瘤深藏，不利于觀察和治療，應用受到一定程度的限制。而皮下移植腫瘤操作簡單，創(chuàng)傷性小，腫瘤淺表便于觀察和治療，可以擴大接種數(shù)量。翟寶進等［4］比較肝癌細胞系HepG2接種裸小皮下和肝原位移植兩種模型，結果發(fā)現(xiàn)多藥耐藥特性并無顯著性差異，提示皮下移植腫瘤與原位移植模型具有相似的生物學行為，利于腫瘤耐藥逆轉劑的篩選觀察。

本研究結果表明，以具有耐羥基喜樹堿為特征的SGC-7901/HCPT胞建立的裸鼠移植瘤模型，不僅成瘤率高(達100%)，而且在裸鼠體內生長良好。SGC-7901/nude的IC50為0.496 μg/mL，SGC-7901/HCPT/nude的IC50為4.381 μg/mL，表明在體內情況下，移植瘤SGC-7901/HCPT/nude仍保持體外的耐藥指數(shù)。wild SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分別為4.686 μg/mL和4.381 μg/mL，表明移植瘤對羥基喜樹堿的耐藥倍數(shù)保持穩(wěn)定。耐藥基因TOPO-Ⅰ的表達下降，則可能是SGC-7901/HCPT耐HCPT形成的分子基礎［5－7］，SGC-7901/HCPT/nude與SGC-7901/nude比較，TOPO-Ⅰ表達水平下降，表明體內腫瘤SGC-7901/HCPT/nude仍具有耐藥基因的表型，而TOPO-Ⅰ在SGC-7901/HCPT/nude與wild SGC-7901/HCPT中的表達差異性無統(tǒng)計意義，表明移植瘤仍保持與體外相似的耐藥基因表型。

綜上所述，SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤腫瘤能保持在體外培養(yǎng)條件下的耐藥特性，其對羥基喜樹堿的耐藥倍數(shù)和耐藥基因表型未產(chǎn)生改變，為建立人類腫瘤細胞多藥耐藥動物模型提供借鑒，亦為體內腫瘤耐藥機制以及逆轉耐藥的研究提供良好的動物平臺。

［1］Thomas H，Coley HM.Overcoming multidrug resistance in cancer:an update on the clinical strategy of inhibiting p-glycoprotein［J］.Cancer Control，2003，10(2):159－165

［2］何一，王崇樹，魏壽江，等.人胃癌耐藥細胞株SGC-7901/HCPT的耐藥機制初探［J］.四川腫瘤防治，2007，20(1):10－12

［3］Harrington DJ，Lessey BA，Rai V，et al.Tenascin is differentially expressed in endometrium and endometriosis［J］.J Pathol，1999，187(2):242－248

［4］翟寶進，伍烽，邵澤勇，等.人肝癌移植瘤多藥耐藥模型的建立及耐藥機制的探討［J］.癌癥，2004，23(8):905－909

［5］Fukuoka K，Adachi J，NishioKt，et al.p16INK4 expressionis associated with the increased sensitivity of human non－small cell lung cells to DNA topoisomerase l inhibitors［J］.JPn J Cancer Res，1997，88(10):1009－1016

［6］Beidler DR，Chang JY，Zhou BS，et al.Camptothecin resistance involving steps subsequent to the formation of protein-linked DNA breaks in human camptothecin-resistant KB cell lines［J］.Cancer Res，1996，56(2):345－353

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The creation and identification of SGC-7901/HCPT cell hetero-transplanted models in nude mice

HE Yi，WANG Chong-shu△，WEI Shou-jiang，WANG Pan
(Department of General Surgery，Affiliated Hospital of North SichuanMedical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

Objective:To establish multi-drug resistance human gastric cancer cell hetero-transplanted models in nude mice and to explore its multi-drug resistance characteristics.Methods:Human gastric cancer cell line SGC-7901 and resistant cell lines SGC-7901/HCPT were inoculated in the left and right subcutaneous part of these nude mouse respectively reared in the SPF level of qualified animal environment.Observed transplanted tumor’growth was compared with the MTT method HCPT tumor cell sensitivity and immunohistochemical determination of the resistance gene expression in TOPO-Ⅰ.Results:SGC-7901 and SGC-7901/HCPT nude mice tumor formation rate was 100%with no self-limiting phenomenon.The growth rate showed no significant difference.Determination SGC-7901/HCPT and SGC-7901/HCPT/nude MTT，IC50 4.686 μg/mL and 4.381 μg/mL，compared with the cells before transplantation showed no significant difference，resistance gene expression by TOPO-Ⅰwas 2.964±0.162 and 2.953±0.172.The difference was not significant meaning.Conclusion:The SGC-7901/HCPT cells established in nude mice xenograft model of subcutaneous resistance had resistance remaining active and in vitro phenotype for the reversal of drug resistance mechanisms and provide a good animal model.

Stomach Neoplasm;Neoplasm Transplantation;Animals

1005-3697(2012)06-0559-03

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.010

四川省科技廳基金項目(02SC02－077)

2012-08-29

何一(1974－)，男，四川西充人，碩士，講師，主要從事胃腸腫瘤研究。

△通訊作者:王崇樹，E-mail:sichuanheyi@126.com網(wǎng)絡出版時間:2012-11-1217∶11

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20121112.1711.016.html