馬克異, 馮建彬, 謝 楠, 馮曉宇, 李家樂,*

(1. 上海海洋大學 省部共建水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306; 2. 浙江省杭州市農業(yè)科學研究院水產研究所，浙江 杭州 310024)

錢塘江日本沼蝦野生群體遺傳變異的SSR分析

馬克異1, 馮建彬1, 謝 楠2, 馮曉宇2, 李家樂1,*

(1. 上海海洋大學 省部共建水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306; 2. 浙江省杭州市農業(yè)科學研究院水產研究所，浙江 杭州 310024)

利用微衛(wèi)星標記分析了錢塘江干流水域聞堰、富陽、場口、桐廬等7個野生日本沼蝦群體的遺傳多樣性和遺傳結構。結果表明：10個微衛(wèi)星位點呈現(xiàn)高度多態(tài)性; 聞堰、富陽、場口、新安江等中下游野生群體的遺傳多樣性水平有高于歙縣和休寧兩個上游群體遺傳多樣性水平的趨勢。符號檢驗和 Wilcoxon符號秩次檢驗的結果表明, 錢塘江日本沼蝦群體近期沒有發(fā)生瓶頸效應, 群體數量也沒有下降。FST的范圍介于0.0201 ～ 0.1069。分子方差分析結果顯示, 大部分的遺傳變異(93.48%)存在于個體間, 少部分遺傳變異(6.52%)存在于群體之間。群體間FST及AMOVA分析表明, 群體處于中等遺傳分化水平; 基于DA遺傳距離構建的NJ聚類樹顯示, 地理位置相鄰的群體聚在一起。STRUCTURE分析413份參試的日本沼蝦樣本被分為2個理論種群, 即上游歙縣和休寧群體為一個理想種群, 其余中下游的5個群體為另一個理想種群。日本沼蝦的遺傳多樣性和遺傳結構與所生存的地理位置具有相關性。

錢塘江; 日本沼蝦; 微衛(wèi)星; 遺傳多樣性; 遺傳結構

日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)俗稱青蝦、河蝦, 是我國重要的淡水經濟養(yǎng)殖蝦類(Li et al, 2005; Feng et al, 2008), 廣泛分布于我國淡水水域,也常出現(xiàn)在低鹽度河口區(qū)。錢塘江流域是日本沼蝦野生資源主要分布區(qū)和重要產區(qū)之一; 但從 20世紀 50年代末以來, 隨著新安江電站和富春江電站的相繼建成并截流, 大大改變了日本沼蝦的野生生活環(huán)境, 加之野生資源的過度采捕, 使得錢塘江流域野生日本沼蝦資源量銳減, 同時由于生產中不注重良種選育, 從而出現(xiàn)了種質退化現(xiàn)象。因此, 錢塘江流域日本沼蝦的種質資源鑒定和評估, 對于保護該蝦野生資源以及促進錢塘江流域淡水養(yǎng)蝦業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。

微衛(wèi)星標記具有多態(tài)性高、共顯性等優(yōu)點, 已廣泛應用于蝦類群體遺傳學、種質鑒定及 QTL定位等研究領域(Brooker et al, 2000; Kancee et al, 2007; Chand et al, 2005)。目前, 日本沼蝦的相關研究主要包括：采用線粒體 COI (Yang et al, 2007; Feng et al, 2008)和16S Rrna (Sun et al, 2007)序列片段變異, 分析了我國五大淡水湖泊、長江、瀾滄江野生群體的遺傳多樣性和系統(tǒng)進化。RAPD(Jiang et al, 2006; Wu et al, 2008; Zhu et al, 2008)方法分析了長江、龍感湖、高郵湖等水域野生群體的遺傳多樣性, 以及微衛(wèi)星標記對洪澤湖(Feng et al, 2010)、太湖(Feng et al, 2010)、長江中下游(Fu et al, 2010)群體進行遺傳多樣性分析。本研究通過微衛(wèi)星變異方法分析了錢塘江干流水域日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性, 探討錢塘江干流水域日本沼蝦群體遺傳結構及群體數量變化, 以期為錢塘江流域日本沼蝦種質資源保護和合理挖掘利用以及良種選育提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 樣本采集及DNA提取

2009年10月在錢塘江上、中、下游水域采集了7個日本沼蝦野生群體, 具體采集點見表1和圖1。每個群體選取59尾, 整個蝦體用無水乙醇固定。苯酚-氯仿法(Sambrook & Russell, 2001)提取日本沼蝦腹部肌肉組織基因組 DNA, 用滅菌的雙蒸水溶解后測定濃度和純度, -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 日本沼蝦樣本采集信息Tab. 1 Details of Macrobrachium nipponense samples in this study

圖1 錢塘江7個日本沼蝦群體的采樣位點Fig. 1 Seven sample sites of Macrobrachium nipponense stock in Qiantang River

1.2 微衛(wèi)星反應

日本沼蝦的 10對微衛(wèi)星引物為自行開發(fā)(表2)。PCR反應采取改良后的 Semi-touchdown PCR方法, 以減少非特異性條帶產生, 反應條件為：(1) 94 ℃ 3 min; (2) 94 ℃ 30 s; (3)(Tm+4)30 s, 遞降1 ℃至Tm; (4)72 ℃ 30 s; (Tm+4)至(Tm+1)各4個循環(huán),Tm時30個循環(huán); (5) 72 ℃ 3 min; (6) 4 ℃保存。產物經1.5%瓊脂糖電泳初檢合格后, 采用QIAxcel全自動毛細管核酸分析系統(tǒng)QIAxcel DNA High Resolution Kit(1200)凝膠卡夾進行基因分型, 以 pUC18 DNA/MspI為標準相對分子質量。

1.3 數據分析

根據條帶位置確定基因型, 利用 GENEPOP 4.0(Rousset, 2008)進行群體遺傳分析, 計算等位基因數(number of allele,A)、有效等位基因數(effective number of allele,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、 期 望 雜 合 度 (expected heterozygosity,He)、香農多樣性指數(Shannon’s information index,I)和基因流(Gene flow,Nm)。用公式計算微衛(wèi)星位點多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC) (Botstein et al, 1980)。

利用ARLEQUIN 3.1(Excoffier et al, 2005)計算群體遺傳分化的F-統(tǒng)計量(F-statistics,FST)及方差分析(AMOVA)。利用DISPAN計算群體間Nei’s遺傳距離(Genetic distance,DA)(Nei et al, 1983), 基于DA構建NJ系統(tǒng)樹, 并進行Bootstrap檢驗。

表2 日本沼蝦微衛(wèi)星引物序列Tab. 2 Sequences of SSR primers of Macrobrachium nipponense

根據各位點等位基因頻率, 基于無限等位基因模型(infinite allele model, IAM)、逐步突變模型(step-wise mutation model, SMM)和雙相突變模型(two-phased mutation model, TPM), 利 用BOTTLENECK 3.4 (Maruyama & Fuerst, 1985)計算平均期望雜合度(expected average heterozygosity,HEQ), 重復為1 000個, 并通過符號檢驗(Sign test)和Wilcoxon符號秩次檢驗(Wilcoxon sign rank test)分析雜合過剩是否顯著, 以通過分析群體突變-漂移平衡來估計日本沼蝦群體數量動態(tài)變化。

利用STRUCTURE2.3(Evanno et al, 2005)進行群體遺傳結構分析, 計算每個K值對應的“Var[lnP(D)]”均值, 然后選擇最佳K值, 即為群體遺傳結構的理論群體數。

2 結果與分析

表3 日本沼蝦10個微衛(wèi)星位點有效等位基因數、雜合度及多態(tài)信息含量Tab. 3 Statistics of number of effective alleles, expected and observed heterozygosity and polymorphism information content for 10 microsatellite loci of Macrobrachium nipponense

2.1 微衛(wèi)星位點的遺傳變異和群體的遺傳多樣性

本研究所用的10對微衛(wèi)星引物在7個群體中均得到了較好的擴增。各位點等位基因數及多態(tài)信息含量如表3所示。10個微衛(wèi)星位點的PIC介于0.66～0.92之間, 根據Botstein等提出的標準, 均屬于高度多態(tài)性位點(PIC＞0.5)。有效等位基因數Ne介于5.91～20.32之間, 與PIC的順序基本一致。

日本沼蝦7個野生群體的多樣性分析見表4。 7個群體Shannon多樣性指數變化范圍為2.15～2.37,由高到低依次為：聞堰＞新安江＞富陽=場口＞歙縣＞休寧＞桐廬; 期望雜合度變化范圍為0.83～0.88, 由高到低依次為：聞堰＞新安江＞富陽=場口＞歙縣＞休寧=桐廬; 有效等位基因數變化范圍為 6.86～9.24,由高到低依次為：聞堰＞場口＞新安江＞富陽＞歙縣＞休寧＞桐廬?？傊? 除桐廬群體外, 錢塘江中下游水域日本沼蝦群體的遺傳多樣性指數普遍高于上游。

2.2 瓶頸效應分析

瓶頸效應分析微衛(wèi)星位點變異情況的結果顯示(表 5), 在 IAM突變模型下, 錢塘江日本沼蝦群體的所有位點HE均高于HEQ; 在TPM突變模型下,除Mni30和Mni102位點外, 其它位點的HE均高于HEQ, 其中Mni34、Mni45、Mni76和Mni82位點差異極顯著; 在SMM突變模型下,Mni34、Mni45、Mni76、Mni82和Mni86位點HE高于HEQ, 其余位點HE低于HEQ, 其中Mni45位點差異顯著,Mni30和Mni102位點差異極顯著。

符號檢驗和 Wilcoxon符號秩次檢驗的結果顯示(表 6), 在 IAM突變模型下, 聞堰群體顯著或極顯著偏離突變-漂移平衡, 表現(xiàn)出顯著或極顯著的雜合過剩; 但在TPM突變模型下, 兩種檢驗均顯示7個群體沒有顯著或極顯著偏離突變-漂移平衡; 而在SMM突變模型下, 兩種檢驗顯示出錢塘江半數群體極顯著偏離突變-漂移平衡, 表現(xiàn)出極顯著的雜合過剩。

2.3 群體遺傳分化

表4 日本沼蝦群體的遺傳多樣性Tab. 4 Summary statistics analysis of genetic diversity in Macrobrachium niponense stocks

表5 日本沼蝦群體微衛(wèi)星位點瓶頸效應分析Tab. 5 Bottleneck test by locus in Macrobrachium nipponense stocks

基于等位基因頻率計算出各群體間的日本沼蝦Nei’s遺傳距離如表7所示, 場口和歙縣群體間遺傳距離最遠(DA=0.3270), 聞堰和富陽群體間遺傳距離最近(DA=0.1334); 7個日本沼蝦野生群體在10個微衛(wèi)星位點上平均的配對FST介于0.0201 ～ 0.1069,接近中等程度分化(0.05＜FST＜0.15)的水平(Hartl & Clark, 1997), 其中聞堰和場口F-統(tǒng)計量最小(FST= 0.0201), 桐廬和歙縣之間最大(FST= 0.1069)。A M O VA 結果顯示(表 8), 群體間遺傳變異，占總變異量的 6.52%, 亦達到中等遺傳分化水平。

基于DA遺傳距離, 用NJ法構建的聚類圖結果如圖2所示, 聞堰和場口、富陽和桐廬群體首先分別聚在一起, 然后再與新安江群體聚類, 最后與歙縣和休寧的聚類聚合。

2.4 群體遺傳結構

表6 日本沼蝦群體突變-漂移平衡分析Tab. 6 Departures from mutation-drift equilibrium in Macrobrachium nipponense stocks

表7 日本沼蝦群體間F–統(tǒng)計量(FST, 對角線下)和遺傳距離(DA, 對角線上)Tab. 7 F–statistics (FST, below diagonal)and genetic distance (DA, above diagonal) among Macrobrachium nipponense stocks

表8 日本沼蝦群體分子方差分析Tab. 8 AMOVA analysis among Macrobrachium nipponense stocks

圖2 基于DA遺傳距離的NJ聚類樹(數字表示Bootstrap的置信度)Fig. 2 NJ clustering tree based on DA genetic distance (Number indicate bootstrap confidence values)

STRUCTURE運算過程不需要預先了解群體的遺傳背景, 因而被認為是用于群體遺傳結構分析的理想工具(Falush et al, 2003)。經過10次重復的

1～7組分群測試, 當K=2時, 出現(xiàn)拐點, 我們推斷出本實驗所用的413份參試個體最佳分組應為2個理論種群(圖3)(Evanno et al, 2005)?？梢钥闯? 劃分的2個理論種群與地理位置有一定相關性, 劃分出的第一個種群包含的個體資源最多, 為錢塘江中下游的新安江、桐廬、場口、富陽和聞堰的個體資源; 第二個種群則包含上游的休寧和歙縣日本沼蝦個體資源。

圖3 參試日本沼蝦種質資源群體結構分組Fig. 3 Estimated population structure for Macrobrachium nipponense germplasm resources

3 討 論

本研究所用 10個微衛(wèi)星位點多態(tài)信息含量PIC介于 0.66～0.92之間, 均屬于高度多態(tài)性位點(Botstein et al, 1980), 可見這些位點能夠較為充分地詮釋錢塘江日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性和遺傳結構。

7個群體平均期望雜合度介于0.83～0.88之間,比洪澤湖日本沼蝦(He=0.698～0.804)(Feng et al, 2010)和泰國羅氏沼蝦(M.rosenbergii)(He=0.64～0.73) (Kancee et al, 2007)高, 可見錢塘江日本沼蝦野生群體具有較高的遺傳多樣性水平。錢塘江中下游5個日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性水平(平均He=0.85,平均I=2.26和平均Ne=8.17)要高于上游的歙縣和休寧兩個群體, 即錢塘江中下游水域日本沼蝦的遺傳多樣性水平自上游到下游呈下降趨勢, 遺傳多樣性的地理位置差異與日本沼蝦適應環(huán)境的能力密切相關, 遺傳多樣性越豐富, 日本沼蝦的適應性和生存能力越強。除了地理位置不同外, 日本沼蝦的遺傳多樣性會不會有可能與適應不同海拔環(huán)境條件有關呢, 這有待進行下一步的研究。從遺傳多樣性水平來看, 我們應該對錢塘江中下游水域的日本沼蝦種質資源給予進一步收集分析, 以不斷豐富錢塘江日本沼蝦種質資源的研究、保護和利用工作。

錢塘江中下游日本沼蝦群體間平均基因流Nm= 2.77, 而上游日本沼蝦群體間平均基因流Nm=2.26,相比之下, 上游日本沼蝦群體間基因交流的水平要低于中下游水域, 這可能是不同水域的水體流量不同所致。歙縣和休寧群體所生存的上游水域水體流量相對較小, 這就對群體之間的基因交流產生影響,導致基因流Nm降低。并且, 歙縣和休寧日本沼蝦群體并非都屬干流群體, 水體自然流動對兩個群體之間的基因交流所起的作用則大大降低; 中下游的新安江等5個日本沼蝦群體則處在干流水域, 水體的自然流動對日本沼蝦群體間的基因交流影響更為突出。水體的自然流動對日本沼蝦的影響還表現(xiàn)在不同水體的注入。歙縣和休寧群體、桐廬和新安江群體的遺傳多樣性參數都呈現(xiàn)出一個規(guī)律, 即不同的水體注入將會影響群體的遺傳多樣性水平, 歙縣群體、新安江群體所處的水域都有新的支流匯入,所以它們相對休寧群體、桐廬群體表現(xiàn)出了較高的遺傳多樣性水平。而綜合不同群體的遺傳多樣性數據, 我們發(fā)現(xiàn)桐廬群體的遺傳多樣性水平為最低,這可能是由于水電大壩影響水體自然流動所致。

處于突變-漂移平衡下的種群, 微衛(wèi)星位點顯示雜合過剩與雜合不足的概率應大致相等。種群在進化中經歷瓶頸效應后, 等位基因數目和雜合度均會降低, 其中等位基因丟失比雜合度降低速度快,從而導致雜合過剩。因此，通過分析雜合度是否過?？梢耘袛喾N群數量是否下降。雜合過剩作為群體數量下降的瞬態(tài)效應, 在SMM突變模型下并不一定都能觀察到, 也只有少數微衛(wèi)星位點完全符合一步的逐步突變模型(Cornuet & Luikart, 1997)。因此,本研究中的微衛(wèi)星數據使用IAM和TPM兩種突變模型相對比較合適。瓶頸效應分析結果顯示, 在IAM 突變模型下, 所有位點表現(xiàn)為雜合過剩; 在TPM突變模型下, 各有8個位點表現(xiàn)為雜合過剩。因此, 微衛(wèi)星位點變異情況反映了錢塘江日本沼蝦群體大部分位點已經雜合過剩, 群體數量已經下降。而突變-漂移平衡的兩種檢驗結果顯示, 在IAM突變模型下只有聞堰群體具有顯著和極顯著雜合過剩位點, 而在 TPM突變模型下錢塘江日本沼蝦不具有顯著或極顯著雜合過剩位點, 各群體沒有偏離突變-漂移平衡, 這一結果又表明, 日本沼蝦野生群體近期的群體數量沒有下降。兩種分析方法出現(xiàn)完全不同結論的原因可能與日本沼蝦的生物學特性有關：日本沼蝦的壽命一般僅14～18個月, 經過越冬的日本沼蝦, 一般在次年的8～10月份死亡, 使得日本沼蝦的數量減少, 這一自然死亡的現(xiàn)象導致了瓶頸效應分析結果有偏差。因此, 本研究認為錢塘江日本沼蝦群體在近期沒有經歷過瓶頸效應, 群體數量沒有下降。而聞堰群體瓶頸效應產生的原因,尚待進一步的研究。瓶頸效應分析是評估種群發(fā)展趨勢的一種方法, 可為水產動物種質資源保護提供參考意見, 對于經歷過瓶頸效應的聞堰群體, 在其育種和保種過程中須加以重視。

群體間遺傳固定指數FST顯示, 群體間遺傳分化指數介于0.0201 ～ 0.1069之間, 屬于中低等程度分化(0.05＜FST＜0.15)(Hartl & Clark, 1997), AMOVA分析結果也顯示了 7個群體處于中等程度分化水平。地理位置的遠近與FST的大小具有相關性, 可見對于日本沼蝦而言, 地理距離對其分化程度有較為重要的影響, 這可能與日本沼蝦的生活習性相關：日本沼蝦游泳能力較弱, 只能作短距離的游動,多數時間攀附于水草或其他水中物體上, 僅在幼苗時期隨水流或者人為攜帶而被動擴散(Feng et al, 2008)。Hamrick等認為以異交為主的物種, 90%的遺傳變異發(fā)生在群體內部(Brown & Clegg, 1989)。本研究的AMOVA分析結果表明, 僅6.52%的遺傳變異發(fā)生在群體間, 而 93.48%的遺傳變異存在于個體間, 與上述結論一致。7個日本沼蝦野生群體的聚類順序也與實際的地理位置分布較為一致。

413份參試的日本沼蝦樣本被分為2個理論種群, 即歙縣和休寧群體為一支, 其余為另一支, 這與基于遺傳距離的NJ聚類樹順序一致?？梢钥闯?劃分的2個種群與地理分布具有相關性。遺傳結構分析表明, 不同地區(qū)的群體遺傳結構和種質資源是不同的, 錢塘江中下游地區(qū)的多樣性水平較高的趨勢更為明顯, 這與水流作用帶來的基因交流有密切關系。被劃分的第一個種群和第二個種群種質資源的群體遺傳結構具有明顯差異, 第一種群的群體遺傳結構比較復雜, 不同個體的種質資源的遺傳結構趨向于二元化, 而被劃分出來的第二個種群的個體的遺傳結構則趨向于一元化。

錢塘江野生日本沼蝦的遺傳多樣性和遺傳結構研究結果表明, 錢塘江中下游水域日本沼蝦的遺傳多樣性有高于上游的趨勢, 遺傳多樣性水平的高低受到了水體自然流動和人類活動的影響。日本沼蝦的遺傳多樣性和遺傳結構也與所生存的地理位置具有相關性。

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Microsatellite analysis of genetic variation of the oriental river prawnMacrobrachium nipponensein Qiantang River

MA Ke-Yi1, FENG Jian-Bin1, XIE Nan2, FENG Xiao-Yu2, LI Jia-Le1,*

(1.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Shanghai Ocean University,Ministry of Education, Shanghai201306,China; 2.Fishery Research Institute,Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou310024,China)

Genetic diversity and genetic structure of 7 wild stocks of oriental river prawnMacrobrachium nipponensein Qiantang River, i.e. Wen-yan, Fu-yang, Chang-kou, Tong-lu, Xin-an-jiang, She-xian and Xiu-ning, were investigated using 10 microsatellite DNA markers. The result showed that all the 10 loci were highly polymorphic. There was a trend that the level of genetic diversity of wild stocks in downstream and midstream were higher than the upstream ones’. Sign test and Wilcoxon sign rank test results showed that the stocks in Qiantang River had no bottleneck effect, and the number of stocks had not declined recently.FSTamong stocks ranged from 0.0201 to 0.1069. Analysis of molecular variance (AMOVA) revealed that a higher portion (93.48%) of variations existed within individuals, while lower portion (6.52%) existed among stocks.FSTand AMOVA analysis across all stocks and loci indicated the medium level of divergence among the stocks. The NJ clustering tree based onDAgenetic distance demonstrated that the stocks of adjacent geographical position clustered together. 413 individuals obtained from six wild stocks could be divided into two potential populations based on the genetic structure. This study demonstrated that genetic diversity and genetic structure ofM. nipponensestocks were relevant to geographical position where they survived.

Qiantang River;Macrobrachium nipponense; Microsatellite; Genetic diversity; Genetic structure

Q959.223.63; Q343.1; Q311.8; Q16

A

0254-5853-(2011)04-0363-08

2010-11-08；接受日期：2011-05-24

國家自然科學基金項目(31001111); 上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金項目(SSC08004); 浙江省杭州市科技局種子種苗項目(20071032H27); 上海海洋大學博士科研啟動基金項目(B-8201-08-0279)

?通訊作者(Corresponding author)，Tel: 021-61900401, E-mail: jlli2009@126.com

馬克異, 男, 碩士研究生, E-mail: mky850125@163.com