戴翠蓮, 張 赟, 姜黔峰

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 貴州 遵義 563003)

MuRF-1在大鼠心肌梗死后慢性心衰心臟中的表達(dá)變化及其分子機(jī)制的探討*

戴翠蓮△, 張 赟, 姜黔峰

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 貴州 遵義 563003)

目的研究肌肉環(huán)指蛋白1(MuRF-1)在心肌梗(MI)死后慢性心衰大鼠心臟中的表達(dá)變化及其分子機(jī)制，對(duì)心功能及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的影響及其與cTnI的關(guān)系。方法將48只制作成功的心肌梗死大鼠及假手術(shù)大鼠納入研究，分為sham組、MI組、MG-132組及TNF-α組，檢測(cè)各樣本血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及血清N末端原腦鈉肽水平(NT-proBNP)，觀察心肌組織學(xué)變化；原位雜交及real-time PCR法半定量測(cè)定心肌組織MuRF-1及cTnI mRNA表達(dá)，Western blotting法確定心肌MuRF-1及cTnI蛋白質(zhì)水平，并對(duì)MuRF-1及cTnI的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果與MI及TNF-α組相比，MG-132能夠顯著降低NT-proBNP(P<0.05)，使心衰的發(fā)生率及死亡率有下降趨勢(shì)，心肌組織損傷減輕，并使大鼠左心室收縮壓(LVSP)升高(P<0.01)，左心室等容收縮期室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)增加(P<0.01)，左心室舒張末壓(LVEDP)明顯降低(P<0.01)。與sham組相比，MI組MuRF-1的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，cTnI水平降低(P<0.05)； MG-132能夠明顯降低心肌梗死后MuRF-1表達(dá)(P<0.05)，升高cTnI水平(P<0.01)；TNF-α則起相反作用。相關(guān)性分析顯示，MuRF-1與cTnI呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論MuRF-1在慢性心衰中表達(dá)顯著升高，使心功能損害加重，其作用通過(guò)抑制cTnI表達(dá)而實(shí)現(xiàn)；抑制蛋白酶體活性能夠通過(guò)抑制MuRF-1表達(dá)而升高cTnI水平，改善心功能。MuRF-1的激活可能是慢性心力衰竭的機(jī)制之一。

心力衰竭； 肌肉環(huán)指蛋白-1； 肌鈣蛋白Ⅰ

心肌梗死后心室重塑是慢性心力衰竭的主要原因，左心室擴(kuò)張、存活心肌細(xì)胞病理性肥大及某些胚胎基因的再表達(dá)是其主要特征[1]。作為鈣離子受體的肌鈣蛋白在心肌收縮狀態(tài)中起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)可能是E3 泛素連接酶肌肉特異性環(huán)指蛋白(muscle ring finger 1, MuRF-1)的特異靶蛋白。E3泛素連接酶MuRF-1與肌小節(jié)粗肌絲的肌聯(lián)蛋白結(jié)合[2]，并且兩者的相互作用可以調(diào)節(jié)肌原纖維M帶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[3]。本實(shí)驗(yàn)以心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠為觀察對(duì)象，通過(guò)上調(diào)或者減少M(fèi)uRF-1的表達(dá)，以研究MuRF1在心肌梗死后慢性心衰中的作用，并對(duì)cTn I 與MuRF-1相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果有助于為心室重塑機(jī)制提供新觀點(diǎn)，并從肌肉萎縮途徑為慢性心衰的預(yù)防提供新方法。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 SD(Sprague-Dawley)大鼠60只，體質(zhì)量(220±50)g，雌雄各半(購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),雌雄分籠飼養(yǎng)。

1.2主要試劑 蛋白酶體抑制劑MG-132(N-[(phenylmethoxy)carbonyl]-L-leucyl -N-[(1S)-1-formyl-3-methylbutyl]-L-leucinamide)購(gòu)于Calbiochem。大鼠N-末端原腦鈉肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP) ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)試劑盒購(gòu)于PhoenixPeptide。腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)購(gòu)于Sigma。MuRF-1兔抗大鼠多克隆抗體(SC-32920),及3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗大鼠多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz。cTnI小鼠抗大鼠單克隆抗體(ab27972)購(gòu)于Abcam。RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、Trizol 及引物設(shè)計(jì)均為T(mén)aKaRa產(chǎn)品。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中衫金橋生物有限公司。PVDF膜為Biometra產(chǎn)品。MuRF-1及cTnI原位雜交試劑盒購(gòu)于上海羅氏公司。BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)為成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品。

2方法

2.1動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)分組 TNF-α及MG-132實(shí)驗(yàn)使用劑量分別參考文獻(xiàn)[4, 5]。慢性心力衰竭模型參照文獻(xiàn)[6]并加以改進(jìn)。同窩出生的成熟大鼠，以3.5%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后接心電圖機(jī)，氣管插管后接小動(dòng)物呼吸機(jī)。于胸骨左緣0.5 cm切開(kāi)皮下組織，減斷第3、4肋骨，暴露胸腔。減開(kāi)心包，暴露動(dòng)脈圓錐和左心耳根部間的左冠狀靜脈，以其為標(biāo)志，于左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending, LAD)發(fā)出約2 mm處穿線后打死結(jié)，以阻斷其血流，造成心肌梗死。假手術(shù)組模型制作相同，但只穿線通過(guò)LAD不打結(jié)。以心電圖改變和心肌顏色變化作為心肌梗死模型成功的標(biāo)志。

根據(jù)不同的干預(yù)手段，將造模成功且24 h后仍存活的48只大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，并立即進(jìn)行以下處理：(1)MG-132組：腹腔內(nèi)注射0.1 mg·kg-1·d-1的MG-132 (溶于2 mL生理鹽水)；(2)TNF-α組：腹腔內(nèi)注射100 ng·g-1·d-1TNF-α (溶于2 mL生理鹽水)；(3)心肌梗死(MI)組：腹腔內(nèi)注射2 mL·d-1生理鹽水；(4)假手術(shù)(sham)組：腹腔內(nèi)注射2 mL·d-1生理鹽水。所有腹腔內(nèi)注射持續(xù)7周。

2.2檢測(cè)指標(biāo)及方法

① 計(jì)算動(dòng)物心衰發(fā)生率及存活率 心衰判斷：精神萎靡、飲食差、活動(dòng)減少、皮膚松弛、毛色欠光亮、氣促，并且尸檢發(fā)現(xiàn)肝淤血、肺淤血伴或不伴胸腔積液、腹腔積液，并結(jié)合血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果進(jìn)行判斷。

② 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 7周后再次給予大鼠3.5%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，接呼吸機(jī)，縱形切開(kāi)右頸部皮膚約1.5-2 cm，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，關(guān)閉頸總動(dòng)脈近心端。剪開(kāi)頸動(dòng)脈并插入1 mm的預(yù)先充滿肝素鹽水的聚乙烯導(dǎo)管，導(dǎo)管另一端與電生理記錄儀壓力感受器相連，導(dǎo)入BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)得左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、心率(heart rate, HR)，同時(shí)同步輸入微分器描記曲線，測(cè)得左心室等容收縮期室內(nèi)壓最大上升速率(the maximum rate of left ventricular pressure rise, +dp/dtmax)、左心室等容舒張期室內(nèi)壓最大下降速率(the maximum rate of left ventricular pressure decrease,-dp/dtmax)。

完成血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后，于腹腔內(nèi)再次注入致死量的水合氯醛，右頸總動(dòng)脈取血，開(kāi)胸并摘取心臟，迅速分離出左心室，并從結(jié)扎點(diǎn)開(kāi)始沿長(zhǎng)軸橫切成2 mm的薄片。取第1片心肌組織制作石蠟包埋切片用于原位雜交及HE染色，第2及第3片分別-80 ℃保存用于熒光定量PCR及Western blotting檢測(cè)。

③ 組織學(xué)觀察 將石蠟包埋后心肌組織切成5 μm薄片，用蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色后顯微鏡下觀察梗死邊緣心肌結(jié)構(gòu)變化。

④ NT-proBNP水平 分離血清，采用雙抗體夾心 ABC-ELISA(avidin-biotin-peroxidase complex enzyme-linked immunosorbent assay) 法檢測(cè)NT-proBNP水平，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。配制好標(biāo)準(zhǔn)品，并將待測(cè)樣品做10倍稀釋。將標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品加入96孔板中，每孔100 μL，充分混勻后置37 ℃ 2 h；洗板3次加第Ⅰ抗體工作液100 μL，混勻后置37 ℃ 1 h；洗板5次并加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板置37 ℃ 30 min；洗板5次，加入底物工作液100 μL，室溫暗處反應(yīng)30 min，加入100 μL終止液混勻，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度值。

⑤ 原位雜交法檢測(cè)MuRF-1及cTnI的mRNA表達(dá)水平 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。石蠟切片脫蠟至水，置打孔液中室溫10 min后置過(guò)氧化氫封閉液室溫20 min，預(yù)雜交1 h；滴加雜交工作液覆蓋組織37 ℃過(guò)夜，分別用0.2× SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液,standard saline citrate)及0.1 mol/L TBS(三乙醇胺緩沖鹽水溶液,triethanolamine-buffered saline solution)洗滌，滴加小鼠抗地高辛生物素標(biāo)記的抗體工作液37 ℃孵育45 min后，辣根過(guò)氧化物酶37 ℃孵育45 min；DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)胞漿陽(yáng)性顏色與細(xì)胞外背景顏色對(duì)比度反差明顯時(shí)，蒸餾水終止反應(yīng)。細(xì)胞漿顯棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，胞核為藍(lán)色。自來(lái)水充分沖洗，脫水透明、封片。高倍鏡下(×200)觀察MuRF-1及cTnI的mRNA表達(dá)情況：在每一張切片的梗死邊緣區(qū)域隨機(jī)選10個(gè)視野，用HPLAS-1000圖像分析系統(tǒng)計(jì)算吸光度(absorbance，A)值，計(jì)算其平均值。

⑥ 熒光定量PCR半定量檢測(cè)MuRF-1及cTnT mRNA表達(dá) 提取心肌總RNA(按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行) ，計(jì)算RNA的純度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)( TaKaRa) ，合成的cDNA儲(chǔ)存在-20 ℃條件下備用。以β-actin為內(nèi)參照, 引物如下：cTnI上游5’-ACCTATGCCGGCAGCTTCA-3’，下游5’- GAGAGTGGGCCGCTTAAACTTG-3’；MuRF-1上游5’-GGGAACGACCGAGTTCAGACTATC-3’，下游5’-GGCGTCAAACTTGTGGCTCA-3’;β-actin上游5’-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3’，下游5’-CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3’。制備cDNA的逆轉(zhuǎn)錄體系為5×PrimeScriptTMbuffer 2 μL，PrimeScriptTMRT enzyme mixⅠ0.5 μL，oligo-dT primer 0.5 μL，random 6-mers 0.5 μL，RNA 1 μL。反應(yīng)參數(shù)為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，循數(shù)1次。定量PCR檢測(cè)在LightCycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行。20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)液中包括SYBR Premix ExTaqTM10 μL，PCR forward primer及PCR reverse primer各0.5 μL，ddH2O 8 μL，模板cDNA 1 μL。cTnI、MuRF-1及β-actin的PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 30 s、61.6 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取其循環(huán)閾值(Ct)均值，分別計(jì)算各組的△C(△Ct=CtMuFR1/cTnI-Ctβ-actin)，再依公式△△Ct =△CtMuFR1/cTnI-△Ctβ-actin計(jì)算△△Ct，2-△△Ct為模板中目的基因的相對(duì)比值。

⑦ Western blotting檢測(cè) MuRF-1及 cTnI 蛋白質(zhì)水平 提取心肌總蛋白(按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，BCA-100法測(cè)定蛋白含量。取100 μg等量蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶封閉1 h后分別與兔抗大鼠MuRF-1、小鼠抗大鼠cTnI及兔抗大鼠GAPDH抗體(以TBS稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為1∶200、1∶500、1∶200)室溫孵育2 h；洗膜后與Ⅱ抗(兔抗小鼠及山羊抗兔IgG)室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、掃描分析。用UVP公司LabWorks 4.5軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，以目的條帶和GAPDH條帶積分吸光度比值作為半定量結(jié)果。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1心衰發(fā)生率及生存率

7周后sham組大鼠無(wú)心衰發(fā)生，MI組、MG-132組及TNF-α組分別有9只、6只和10只發(fā)生心衰，其發(fā)生率為75%、50%和83%。與sham組相比，MI組和TNF-α組心衰的發(fā)生率顯著增加(P<0.05)，而MG-132組較MI組有下降趨勢(shì)。MI組2只死于心衰，TNF-α組3只死于心衰，MG-132組無(wú)死亡。對(duì)以上組各取6只存活且發(fā)生心衰的大鼠進(jìn)行研究并用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

圖1結(jié)果顯示，與sham組相比，MI組的心率明顯增快，LVSP降低，LVEDP增高，+dp/dtmax及-dp/dtmax均降低，差異均顯著(P<0.01)，TNF-α組更進(jìn)一步加重了心功能損害；與MI組和TNF-α組比較，MG-132組上述心功能指標(biāo)得到改善，且差異均顯著(P<0.01)。

Figure 1. Cardiac hemodynamic changes. The myocardial infarction model in rats was induced by ligating left anterior descending coronary artery. For sham surgical operating, left anterior descending coronary artery was not ligated. The rats,which survived 24 h after modeling, were treated with proteasome inhibitor MG-132, TNF-α or saline by intraperitoneal injection. Sham: sham group; MI: myocardial infarction group; MG-132: MG-132 group(MI rats treated with MG-132 for 7 weeks, 0.1 mg·kg-1·d-1, ip); TNF-α: tumor necrosis factor α group(MI rats were treated with TNF-α for 7 weeks, 100 ng·kg-1·d-1,ip); LVSP: left ventricular systolic pressure; LVEDP: left ventricular end-diastolic pressure;+dp/dtmax: the maximum rate of left ventricular pressure rise; -dp/dtmax: the maximum rate of left ventricular pressure decrease. ±s. n=6.**P<0.01.

3病理形態(tài)學(xué)

HE染色結(jié)果顯示，與sham組相比，MI組及TNF-α組可見(jiàn)大片心肌壞死，疤痕組織形成，結(jié)締組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，殘存心肌水腫；尤以TNF-α組為重，僅可見(jiàn)島狀心肌結(jié)構(gòu)。MG-132組上述損害減輕，見(jiàn)圖2。

4NT-proBNP水平

與sham組相比，MI組NT-proBNP水平明顯增高(P<0.01)；TNF-α組較MI組進(jìn)一步增加；與MI組及TNF-α組比較，MG-132組NT-proBNP水平均顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖3。

5RT-PCR檢測(cè)MuRF-1及cTnI的mRNA表達(dá)(圖4)

5.1MuRF-1 mRNA表達(dá)水平 Sham組MuRF-1 mRNA呈低水平表達(dá)，與其相比，MI組則顯著增加(P<0.05)，TNF-α組更進(jìn)一步上調(diào)了MuRF-1 mRNA水平。與MI組和TNF-α組相比，MG-132則使MuRF-1的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

Figure 2. Left ventricular myocardial infarction sections stained with hematoxylin-eosin(×200). A: sham group； B: MI group; C: MG-132 group; D: TNF-α group.

Figure 3. Detection of plasma NT-proBNP level. NT-proBNP: N-terminal pro-brain natriuretic peptide. Sham: sham group; MI: myocardial infarction group; MG-132: MG-132 group; TNF-α: tumor necrosis factor α group.±s.n=6.**P<0.01.

5.2cTnI的mRNA表達(dá)水平 MI組cTnI為0.63±0.26，明顯低于sham組(1.78±0.89)，差異顯著(P<0.05)。與MI組相比，MG-132組cTnI表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；TNF-α組cTnI的表達(dá)量(0.20±0.04)則明顯低于MI組(P<0.01)。

5.3MuRF-1與cTnI mRNA表達(dá)量的相關(guān)性分析 對(duì)4組大鼠心肌中MuRF-1和cTnI的mRNA 表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示MuRF-1與cTnI之間呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.56，P<0.01。

6原位雜交(圖5)

6.1心肌MuRF-1吸光度(A)值 與sham組比較，MI組MuRF-1 mRNA 的A值為208.52，差異顯著(P<0.01)。與MI組比較，MG-132組顯著下調(diào)了MuRF-1的表達(dá)(A=143.63，P<0.01)，但高于sham組；TNF-α組顯著上調(diào)了MuRF-1的水平。

6.2心肌cTnIA值 與sham組比較，MI組cTnI mRNA的表達(dá)量降低(P<0.01)，差異顯著。與MI組相比較，MG-132組cTnI mRNA的表達(dá)量有升高趨勢(shì)(P<0.01)，TNF-α組cTnI mRNA的表達(dá)量則顯著降低(P<0.01)。

6.3MuRF-1與cTnI mRNA吸光度值相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MuRF-1與cTnI的mRNA 表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.83，P<0.01)。

7Westernblotting檢測(cè)MuRF-1與cTnI的蛋白質(zhì)水平(圖6)

7.1MuRF-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平 經(jīng)內(nèi)參照校正后，MI組MuRF-1蛋白質(zhì)水平明顯高于sham組，差異顯著(P<0.01)。與MI組相比較，MG-132抑制了MuRF-1蛋白質(zhì)水平(P<0.05)，但仍高于sham組。而TNF-α則顯著上調(diào)了MuRF-1的蛋白質(zhì)表達(dá)(P<0.01)。

Figure 4. Quantification of MuRF-1(A) and cTnI(B) mRNA expression as well as correlation analysis between the expression of MuRF-1 and troponin I(C) in the myocardium were measured by real-time PCR. Sham: sham group; MI: myocardial infarction group; MG-132: MG-132 group; TNF-α: tumor necrosis factor-α group. ±s. n=6.*P<0.05,**P<0.01.

Figure 6. Relative protein expression of MuRF-1(A, C) and cTnI(B, C) as well as the correlation of MuRF-1 and cTnI(D) in the myocardium. Relative protein expression of MuRF-1 and cTnI was quantified densitometrically using the LabWorks 4.5 software and calculated according to the GAPDH reference bands. Sham: sham group; MI: myocardial infarction group; MG-132: MG-132 group; TNF-α: tumor necrosis factor α group. ±s. n=6. *P<0.05,**P<0.01.

7.2cTnI的蛋白質(zhì)表達(dá)水平 經(jīng)內(nèi)參照校正后，與sham組相比較，MI組cTnI蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低(P<0.01)，差異顯著。與MI組相比，MG-132組cTnI蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，TNF-α組cTnI蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低，差異顯著(P<0.01)。

7.3MuRF-1與cTnI蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)性分析 對(duì)4組大鼠心肌MuRF-1和cTnI的蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示MuRF-1與cTnI之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.93，P<0.01)。

討 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，心肌梗死后7周大鼠心功能顯著惡化，心肌結(jié)構(gòu)紊亂；TNF-α使上述心肌損害加重，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)MuRF-1的水平，加速心肌cTnI降解所致。當(dāng)使用蛋白酶體抑制劑MG-132后，MuRF1表達(dá)降低，cTnI水平升高，大鼠的心肌結(jié)構(gòu)和心功能得到改善。

本實(shí)驗(yàn)中，MG-132組大鼠慢性心力衰竭的發(fā)生率為50%，較心肌梗死組(75%)有下降趨勢(shì)；與MG-132組相比，MI組和TNF-α組的死亡率有增加趨勢(shì)，無(wú)明顯差異的原因可能主要在于樣本量較小。但結(jié)果說(shuō)明抑制蛋白酶體系統(tǒng)能夠使心衰大鼠的死亡率、心肌梗死后心衰的發(fā)生率有下降趨勢(shì)。而且，MG-132還顯著降低了MI組大鼠的左室舒張末壓，使左室最大收縮速率增加，作為慢性心力衰竭重要指標(biāo)之一的NT-proBNP[7]水平降低，改善了大鼠的心臟功能，再次印證了我們以前的研究結(jié)果[8]，即蛋白酶體抑制劑具有心肌保護(hù)作用，且能夠降低NT-proBNP水平。

心力衰竭的發(fā)生機(jī)制目前還不明確，越來(lái)越多的證據(jù)表明泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能失衡是其重要原因。由于蛋白質(zhì)合成及降解的精確調(diào)控維持了正常的心臟結(jié)構(gòu)和功能[9]，蛋白質(zhì)質(zhì)量控制異常將會(huì)引起心肌纖維退化和心力衰竭的發(fā)生[10]，而作為蛋白質(zhì)質(zhì)量控制之一的泛素蛋白酶體系統(tǒng)可能起了重要作用。目前認(rèn)為，與心肌萎縮相關(guān)的E3泛素連接酶MuRF-1與肌小節(jié) M帶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[2, 3]有關(guān)，cTnI可能是MuRF1的底物之一且具有高度選擇性[11]。

由于蛋白酶體抑制劑MG-132能夠抑制26S蛋白酶體，從而阻斷E3泛素連接酶MuRF1的活性，而TNF-α能夠升高M(jìn)uRF-1約3倍[12]。為研究與萎縮相關(guān)的MuRF-1在慢性心力衰竭中的作用，故本實(shí)驗(yàn)特設(shè)MG-132組和TNF-α組作為對(duì)照研究，以抑制或者刺激MuRF-1表達(dá)，從而觀察MuRF1在慢性心衰中的作用。

本研究中，原位雜交和熒光定量PCR半定量結(jié)果均顯示，心肌梗死顯著增加了MuRF-1 mRNA水平，而cTnI表達(dá)則顯著降低，TNF-α卻使MuRF-1 mRNA水平更加升高，MG-132有效地抑制了MuRF-1 mRNA水平；Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組大鼠的MuRF-1與cTnI的蛋白質(zhì)水平與其mRNA表達(dá)相吻合，而且MuRF1的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均與cTnI表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。這與Conraads等[13]的研究結(jié)果一致。但他們發(fā)現(xiàn)在2周內(nèi)發(fā)生心肌梗死的患者其遠(yuǎn)離心肌梗死部位MuRF-1的表達(dá)水平降低、心肌肥厚，這與本研究結(jié)果不同，但本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為慢性心力衰竭樣本(心梗后7周)，與Conraads等[13]的樣本不同(心梗2周內(nèi))，而且該實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)了遠(yuǎn)離心肌梗死部位的心肌組織，故具有一定的局限性，而且，近期研究表明，慢性心衰模型中泛素蛋白酶體的活性是被激活的[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)從基因水平及蛋白質(zhì)水平均證明，心肌梗死后心力衰竭與心肌中MuRF-1的上調(diào)有關(guān)，而且MuRF-1 的上調(diào)加速了cTnI的降解，這可能是慢性心力衰竭的重要原因。這與體外研究報(bào)道一致[12]，而且研究還發(fā)現(xiàn)，MuRF-1轉(zhuǎn)基因大鼠的心臟表現(xiàn)出左心室壁變薄和心功能受損；在主動(dòng)脈縮窄的模型中，MuRF-1轉(zhuǎn)基因大鼠可導(dǎo)致心臟快速衰竭，超生心動(dòng)描記術(shù)顯示，與野生型大鼠相比，左心室的前壁與后壁的厚度分別減少了19.3%和19.8%，射血分?jǐn)?shù)降低[15]。說(shuō)明MuRF-1的過(guò)表達(dá)促進(jìn)心肌梗死后心衰的發(fā)生。由于MuRF-1對(duì)cTnI的作用，意味著可能通過(guò)對(duì)MuRF-1的調(diào)節(jié)以減緩慢性心力衰竭心室重塑的進(jìn)程。

本研究還證明，TNF-α能夠上調(diào)慢性心衰大鼠心臟的MuRF-1水平，可以做這樣的推測(cè)，即TNF-α對(duì)心肌的損害作用一個(gè)重要方面是通過(guò)上調(diào)MuRF-1實(shí)現(xiàn)的。由于cTnI的降解與心肌收縮力的損害有關(guān)[16]，cTnI降解越嚴(yán)重，單個(gè)心肌細(xì)胞收縮力越低[17]，cTnI的缺失可導(dǎo)致大鼠心肌收縮力的降低和心功能失常[15]。MuRF-1對(duì)cTnI具有特異性、靶向性降解的能力，因此通過(guò)腹腔內(nèi)注射TNF-α增加MuRF-1的表達(dá)會(huì)影響cTnI的穩(wěn)定性。體外研究[11]支持了本研究的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，增加MuRF-1的表達(dá)可以導(dǎo)致cTnI的半衰期縮短[11]。當(dāng)用MG-132干預(yù)后，MuRF-1轉(zhuǎn)基因的大鼠中cTnI的水平增加了210%，免疫沉淀法發(fā)現(xiàn)MuRF-1增加cTnI的泛素化降解，MG-132增加了cTnI的水平。

MuRF-1對(duì)肌鈣蛋白的作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)其能量代謝和蛋白質(zhì)合成而實(shí)現(xiàn)的。近期研究表明，MuRF-1的激活可以引起肌鈣蛋白翻譯異常[4]而導(dǎo)致骨骼肌收縮力降低，與丙酮酸脫氫酶和3-羥基脫氫酶有關(guān)[18]。因此，MuRF-1對(duì)于心梗后心衰心肌的作用是否也存在著能量代謝和蛋白合成與降解之間的協(xié)同偶聯(lián)機(jī)制還需要進(jìn)一步證明。

本研究證明，在慢性心力衰竭的心肌中，cTnI是E3泛素連接酶MuRF1的底物蛋白，通過(guò)抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)能夠抑制MuRF1所致的泛素化降解，從而改善心功能。此研究為慢性心力衰竭的治療提供了新的治療思路。

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Transformationofmuscleringfinger1onchronicheartfailureinmyocardialinfarctionrats

DAI Cui-lian, ZHANG Yun, JIANG Qian-feng

(DepartmentofCardiology,TheAffiliatedHospital,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:dai_cui_lian@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the change and the mechanism of muscle ring finger 1(MuRF-1) on heart functions and cardiac troponin I(cTnI) in myocardial infarction rats and to analyze the correlation between MuRF-1 and cTnI.METHODSThe rats either with coronary artery ligation or with sham operation(48 rats) were divided into 4 groups: sham(sham-operated) group, MI(myocardial infarction) group, MG-132(N-[(phenylmethoxy)carbonyl]-L-leucyl-N-[(1S)-1-formyl-3-methylbutyl]-L-leucinamide) group and TNF-α(tumor necrosis factor alpha) group.The animals were treated with saline(sham and MI group),MG-132(MG-132 group) or TNF-α(TNF-α group) by intraperitoneal injection. Hemodynamics, N-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP) and cardio-pathologic changes were observed. Both mRNA and protein expressions of MuRF-1 and cTnI in the left ventricles were determined by real-time PCR andinsituhybridization or by Western blotting. The correlation between MuRF-1 and cTnI was also analyzed.RESULTSCompared with MI group and TNF-α group, the mortality and the morbidity of the animals had a decreasing tendency in MG-132 group, and NT-proBNP level as well as the left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP) were significantly decreased(P<0.05 andP<0.01, respectively).Left ventricular systolic pressure(LVSP) and the maximum rate of left ventricular pressure rise(+dp/dtmax) were pronouncedly increased(P<0.01).The heart injury was also amended after MG-132 treatment. Compared with sham group, the mRNA and protein relative expressions of MuRF-1 were predominantly increased in MI group(P<0.05), and the cTnI levels were decreased (P<0.05). MG-132 depressed the level of MuRF-1(P<0.05) and enhanced the level of cTnI(P<0.01) at both mRNA and protein levels. In contrast, treatment with TNF-α worsened the heart failure,reduced the cTnI level and raised MuRF-1 level. The expression of MuRF-1 at mRNA and protein levels had significantly negative correlation with the expression of cTnI in all groups.CONCLUSIONThese data suggest that MuRF-1 is significantly increased in chronic heart failure and aggravates heart dysfunction by depressing cTnI level. Inhibition of proteasome activity diminishes MuRF-1 expression. MuRF-1 may be involved in the mechanism of chronic heart failure.

Heart failure; Muscle ring finger 1; Troponin Ⅰ

R541.05

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-002

1000-4718(2011)02-0215-08

2010-08-30

2010-10-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30860295)

△通訊作者 Tel： 0852-8609001； E-mail: dai_cui_lian@yahoo.com.cn