趙玉紅， 吳麗霞， 關(guān) 心， 王 偉， 趙玉巖

(1沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng) 110002；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠的脂代謝紊亂與下丘腦中增食欲素A的表達(dá)分析*

趙玉紅1△， 吳麗霞1， 關(guān) 心1， 王 偉1， 趙玉巖2

(1沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng) 110002；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

目的： 研究營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠下丘腦中增食欲素(orexin A)表達(dá)與脂代謝紊亂的規(guī)律。方法高脂飲食誘導(dǎo)并評(píng)估營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠動(dòng)物模型；采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法和生化酶法測(cè)定大鼠血清胰島素(Ins)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)下丘腦組織中orexin A mRNA的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果大鼠高脂膳食飼養(yǎng)8周后，營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠的體重、體脂含量和Lee′s指數(shù)均高于對(duì)照組，血清Ins增加約50％，TG和TC分別增加約94％和43％(Plt;0.05)；營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠下丘腦中orexin A的mRNA表達(dá)減少約57 ％ (Plt;0.05),且orexin A的表達(dá)量與Lee′s指數(shù)、Ins、TG、TC呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.798 (Plt;0.05)、r=-0.868(Plt;0.05)、r=-0.981(Plt;0.05)和r=-0.815(Plt;0.05)。結(jié)論在大鼠高脂膳食誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)性肥胖過(guò)程中，下丘腦orexin A的低表達(dá)和脂代謝紊亂均與營(yíng)養(yǎng)性肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。

增食欲素A；肥胖癥；脂代謝; 基因表達(dá)

肥胖是指進(jìn)食熱量多于身體消耗量,以脂肪形式儲(chǔ)存于體內(nèi)，目前已成為現(xiàn)代社會(huì)中最常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)障礙性疾病。肥胖是一種由食欲和能量調(diào)節(jié)紊亂引起的疾病,與基因、環(huán)境、膳食結(jié)構(gòu)等多種因素有關(guān),其發(fā)病原因與遺傳、中樞神經(jīng)異常、營(yíng)養(yǎng)、內(nèi)分泌功能紊亂等因素密切相關(guān)[1]。增食欲素A(orexin A)是由下丘腦組織中合成并分泌的一種神經(jīng)肽，通過(guò)其受體調(diào)節(jié)攝食、應(yīng)激等多種生理過(guò)程，在肥胖和糖尿病發(fā)生中起重要作用[2]。但orexin A在肥胖病理狀態(tài)中的調(diào)控效應(yīng)尚不清楚。本研究探討orexin A在營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠下丘腦組織中的表達(dá)與脂代謝的變化規(guī)律，以期闡明orexin 系統(tǒng)與機(jī)體脂類(lèi)代謝紊亂的相關(guān)性和意義。

材 料 和 方 法

1營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)

2血糖和脂代謝檢測(cè)

應(yīng)用微型血糖儀測(cè)定全血葡萄糖(blood glucose，BG)；采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法(DPC)檢測(cè)大鼠血清胰島素(insulin，Ins)水平；采用生化酶法(Roche)大鼠血清甘油三酯(triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol，TG)。

3實(shí)時(shí)定量PCR分析下丘腦組織orexinAmRNA表達(dá)

大鼠喂養(yǎng)8周后，無(wú)菌條件下快速解剖其腦組織，將下丘腦定位區(qū)域(前邊界為乳頭體，后邊界為視交叉，深約2 mm)分離取出，按Total RNA Isolation System(Gibco)說(shuō)明分離提取下丘腦總RNA。PCR反應(yīng)引物序列如下: orexin A上游引物5’-CGG ATT GCC TCT CCC TGA GC-3’，下游引物5’-GCA ACC GCC ACC GCT TTA G-3’； β-actin上游引物5’-AGA GCT ACG AGC TGC CTG AC-3’，下游引物5’- AGT ACT TGC GCT CAG GAG GA -3’。應(yīng)用Light-cycler real-time PCR儀(Roche)和Syber-Green RNA擴(kuò)增試劑盒(Roche)，采用一步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)方案依據(jù)試劑盒操作步驟。反應(yīng)條件為：逆轉(zhuǎn)錄55 ℃ 10 min,變性95 ℃ 40 s,循環(huán)條件為：95 ℃ 0 s，57 ℃ 10 s,72 ℃ 18 s，45個(gè)循環(huán)。熔解曲線(xiàn)分析條件為：95 ℃ 0 s，65 ℃ 10 s，95 ℃ 0 s，冷卻40 ℃ 30 s。分析時(shí)用pSV2- orexin作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以β-actin為內(nèi)參照。每個(gè)樣品做5次檢測(cè)，計(jì)算目的基因和β-actin的比值。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1高脂膳食誘導(dǎo)大鼠脂代謝紊亂

高脂膳食喂養(yǎng)8周后，大鼠的體重、體脂含量和Lee′s指數(shù)均高于正常對(duì)照組，見(jiàn)表1；血清Ins增加約50％，TG和TC分別增加約94％和43％，見(jiàn)表2，差異顯著(Plt;0.05)。

表1 高脂膳食誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠的脂代謝異常

2營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠下丘腦orexinA的表達(dá)及其相關(guān)性

高脂膳食喂養(yǎng)8周后，營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠下丘腦orexin A的mRNA的表達(dá)量比正常對(duì)照組減少57％ ，見(jiàn)表2，差異顯著(Plt;0.05)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠orexin A的表達(dá)量與Lee′s指數(shù)、Ins、TG、TC呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.798 (Plt;0.05)、r=-0.868 (Plt;0.05)、r=-0.981(Plt;0.05)和r=-0.815 (Plt;0.05)；而orexin A的表達(dá)量與大鼠血糖及體脂含量無(wú)明顯相關(guān)性。

表2 高脂膳食誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠的脂代謝與orexin A表達(dá)

討 論

肥胖是一種由食欲和能量調(diào)節(jié)紊亂引起的疾病，其發(fā)病原因與遺傳、中樞神經(jīng)異常、營(yíng)養(yǎng)、內(nèi)分泌功能紊亂等因素密切相關(guān)。有研究顯示，肥胖癥中許多內(nèi)分泌、神經(jīng)、激素、細(xì)胞內(nèi)等途徑失調(diào)[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)很多生物因子與肥胖及肥胖的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如游離脂肪酸、甘油、激素、致炎因子等[5]。Orexin A表達(dá)于涉及攝食行為的側(cè)下丘腦區(qū)域，參與能量代謝、心血管功能、激素平衡及睡眠/喚醒行為等多種生理或病理過(guò)程。Orexin A可以劑量依賴(lài)方式增加攝食[6]，是機(jī)體能量平衡調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的重要物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂膳食誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠體內(nèi)下丘腦中orexin的基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示能量代謝異?？烧{(diào)節(jié)下丘腦功能，機(jī)體可能通過(guò)對(duì)orexin A基因表達(dá)的調(diào)節(jié)干預(yù)體內(nèi)的脂類(lèi)代謝。

Orexin A調(diào)控的因素還涉及其它內(nèi)分泌和代謝的敏感因素。血清胰島素及脂代謝的變化都可能參與了orexin A的調(diào)節(jié)。下丘腦側(cè)部是攝食中樞，這個(gè)部位損傷可抑制進(jìn)食，使體重下降，這表明該區(qū)域是調(diào)節(jié)進(jìn)食和能量平衡的關(guān)鍵部位。對(duì)體質(zhì)指數(shù)(BMI)為 19.8-59.0 的人進(jìn)行血漿orexin A和瘦素測(cè)定，發(fā)現(xiàn) orexin A水平與BMI成負(fù)相關(guān)，瘦素水平與BMI呈正相關(guān)[7]。單純性肥胖及病態(tài)肥胖患者血漿orexin A水平明顯低于正常對(duì)照組，這一步說(shuō)明orexin參與機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)[8]。Beck等[9]報(bào)告orexin A的表達(dá)與血清TG呈負(fù)相關(guān)。而Wortley等人[10]研究發(fā)現(xiàn)，有肥胖傾向大鼠的orexin A神經(jīng)元具有脂肪敏感性，對(duì)循環(huán)中的脂類(lèi)產(chǎn)生應(yīng)答，當(dāng)機(jī)體處于高脂血癥狀態(tài)下，orexin A基因表達(dá)是增加的。這與本研究的結(jié)論相矛盾。我們認(rèn)為，orexin A除中樞性增加攝食外，尚可通過(guò)外周對(duì)胰島素的直接刺激作用導(dǎo)致脂肪同化，最終引起肥胖、胰島素抵抗、脂代謝異常的發(fā)生和發(fā)展。脂代謝異常作為胰島素抵抗的一個(gè)重要標(biāo)志，脂代謝與orexin A的之間更深層次的作用機(jī)制有待深入研究。

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HypothalamicexpressionoforexinAandlipidmetabolismdisorderinratswithalimentaryobesity

ZHAO Yu-hong1,WU Li-xia1,GUAN Xin1,WANG Wei1,ZHAO Yu-yan2

(1DepartmentofLaboratoryMedicine,TheSecondAffiliatedHospitalofShenyangMedicalCollege,Shenyang110002,China;2DepartmentofEndocrinology,FirstClinicalHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail：G572@sina.com)

AIM: To evaluate the effect of orexin A in rat hypothalamus on lipid metabolism disorder in rats with alimentary obesity induced by high-fat diet.METHODSThe rat model of alimentary obesity was induced by high-fat diet.The levels of insulin,triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) in the serum were detected by luminescent immunoassay and enzymic method.The mRNA expression of orexin A in rat hypothalamus was determined by real-time PCR.RESULTSThere were statistically significant differences of weight,body fat content,and Lee′s index between high-fat diet group and control group after 8-week feeding of high-fat diet.Compared to control animals,the levels of insulin,TG and TC in the rats with alimentary obesity significantly increased by 50％,94％ and 43％,respectively (Plt;0.05).The expression of orexin A in rat hypothalamus significantly decreased by 57％,and had significant negative correlation with Lee′s index,insulin,TG and TC.Their correlation coefficients werer=-0.798 (Plt;0.05),r=-0.868 (Plt;0.05),r=-0.981(Plt;0.05) andr=-0.815 (Plt;0.05),respectively.CONCLUSIONAlimentary obesity and lipid metabolism disorder induced by high-fat diet are correlated with down-regulation of orexin A expression in rat hypothalamus.

Orexin A; Obesity; Lipid metabolism; Gene expression

1000-4718(2011)05-1000-03

R459.52

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.032

2010-05-31

2011-03-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30872724)；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20082116)；遼寧省科技攻關(guān)層次計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2008225009; No.2009225010-3)

△通訊作者 Tel：024-83282538;E-mail：G572@sina.com