鐘良英， 丁紅珂， 袁 萍， 裴元元， 王一鳴, 黃瑋俊

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

EXT2基因突變引起的多發(fā)性骨軟骨瘤的遺傳學(xué)及表型分析*

鐘良英， 丁紅珂， 袁 萍， 裴元元， 王一鳴, 黃瑋俊△

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

目的： 對2個(gè)多發(fā)性骨軟骨瘤(multiple exostoses)小家系中的先證者進(jìn)行致病基因EXT1和EXT2編碼序列的突變檢測，尋找致病性突變。方法應(yīng)用PCR擴(kuò)增EXT1和EXT2基因的編碼區(qū)及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)，對產(chǎn)物進(jìn)行直接測序。在50個(gè)正常對照中進(jìn)行新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)的PCR測序分析，以排除多態(tài)性。結(jié)果家系1的先證者檢測到1個(gè)EXT2基因的已知突變c.668Ggt;C(p.Arg223Pro)，該錯(cuò)義突變使精氨酸變成脯氨酸；家系2的先證者于EXT2基因中檢測到1個(gè)國際數(shù)據(jù)庫中尚未報(bào)道的新突變c.950delT(p.Phe317SerfsX15)，患者父母均未檢測到此突變，故此突變?yōu)橐粋€(gè)denovo突變。該突變引起開放閱讀框架移位，提前引入終止密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的截?cái)?，即部分exostosin結(jié)構(gòu)域和全部glyco-transf-64結(jié)構(gòu)域的丟失。結(jié)論本文發(fā)現(xiàn)的EXT2基因的新生及已知突變是引起本研究中多發(fā)性骨軟骨瘤患者發(fā)病的分子機(jī)制，可用于臨床的分子診斷。

外生骨疣，多發(fā)性遺傳性; 基因，EXT1； 基因，EXT2；denovo突變

多發(fā)性骨軟骨瘤(multiple exostoses)是一種常染色體顯性遺傳性的骨發(fā)育障礙疾病，接近80％的患者有陽性家族史[1]。主要表現(xiàn)為長骨近骨骺端多發(fā)性良性外生性骨疣[2]，常常累及腿、前臂以及手[3]，導(dǎo)致骨骼畸形，如前臂縮短和彎曲等，患者常有不成比例的身材矮小[4,5]。多發(fā)性骨軟骨瘤還可能會引起一些并發(fā)癥，如由于鄰近組織、血管、神經(jīng)、肌腱受壓導(dǎo)致的關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)受限和疼痛等。 該病在人群中的發(fā)病率約1/50 000，男性多見，男女之比約為1.5∶1[6]，有0.5％-5％的患者可能惡變?yōu)檐浌侨饬龌蛘吖侨饬鯷5,7,8]。

在遺傳學(xué)上，多發(fā)性骨軟骨瘤雖然具有異質(zhì)性(genetic heterogeneous)，但超過70％的病例是由已克隆的致病基因EXT1(exostosin-1,MIM ID 608177)[9]和EXT2(exostosin-2,MIM ID 608210)[10]的突變所致[11]，大多數(shù)的致病性突變主要是引起編碼蛋白質(zhì)的截?cái)郲12]以致功能域的喪失，從而導(dǎo)致野生蛋白的功能喪失。

本研究收集到2個(gè)多發(fā)性骨軟骨瘤小家系，我們對家系中的先證者進(jìn)行了EXT1和EXT2 基因編碼區(qū)及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)的突變篩查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑和儀器 (1)試劑：dNTPs (上海生工生物工程有限公司)、Taq DNA聚合酶(晶美生物有限公司)、DL2000 marker (TaKaRa大連寶生物公司)、SAP酶 (TaKaRa大連寶生物公司)、ExoⅠ(TaKaRa大連寶生物公司)、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)、Goldview DNA染料(北京賽百勝生物有限公司)、血液基因組提取試劑盒(天根有限公司)等。(2)儀器：GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems)、東盛龍PCR儀(東盛創(chuàng)新生物科技有限公司)、Biometra PCR儀、凝膠成像分析儀(UVP)、Beckman Coulter DU730 nucleic acid/protein analyzer、Eppendorf centrifuge 5415R、Sartorius 純水儀、3730XL DNA analyzer(Applied Biosystems)等。

1.2病人資料 本研究收集了2個(gè)小家系(圖1)。家系成員均經(jīng)過詳細(xì)的臨床檢查，患者還經(jīng)過相應(yīng)部位的X光檢查。多發(fā)性骨軟骨瘤的診斷按國際通用標(biāo)準(zhǔn)[13]。家系1中的先證者及父親和家系2中的先證者被診斷為患者，余家庭成員健康。

Figure 1.Pedigrees of families with multiple exostoses.Filled circles and squares denote affected family members.Arrows indicate probands.

2方法

2.1DNA提取 取外周血200 μL，按天根血液基因組小量抽提試劑盒(天根生化，北京)要求抽提DNA。

2.2引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 從數(shù)據(jù)庫UCSC Human Genome Browser (http://genome.ucsc.edu) (NCBI36/hg18)提取EXT1和EXT2 基因的序列，引物序列與文章[13]所有序列相同,見表1。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為30 μL：10×PCR緩沖液3 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、2 mmol/L dNTP混合物3 μL、3.2 μmol/L上、下游引物各1.5 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、DNA模板1 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足體積至30 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s、引物特異性溫度退火1 min、72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 EXT1和EXT2基因擴(kuò)增引物

2.3PCR產(chǎn)物測序及突變鑒定 對PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序分析：(1)測序預(yù)反應(yīng)：SAP酶0.6 μL、、ExoⅠ 0.15 μL、10×buffer 0.3 μL 、PCR產(chǎn)物1 μL、滅菌ddH2O 0.95 μL，反應(yīng)條件：37 ℃15 min，85 ℃15 min。(2)測序PCR反應(yīng)：預(yù)反應(yīng)混合液3 μL，BigDye 0.3-0.8μL，測序引物1 μL(3.2 μmol/L)，補(bǔ)足ddH2O組成10 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行測序PCR。擴(kuò)增程序：98 ℃ 2 min；96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，30個(gè)循環(huán)。(3)測序PCR產(chǎn)物純化及上機(jī)：3 mol/L 醋酸鈉 (pH 5.2)和無水乙醇沉淀測序產(chǎn)物，再用75％乙醇洗滌1次，加10uL滅菌ddH2O溶解2-4 h；純化產(chǎn)物95 ℃變性5 min，立即冰浴3 min，使其保持單鏈狀態(tài)；轉(zhuǎn)移至3730XL DNA analyzer上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。(4)測序結(jié)果鑒定：應(yīng)用軟件 Sequence Scanner 1.0(Applied Biosystems)對測序結(jié)果進(jìn)行分析判讀。(5)將所得突變進(jìn)行遺傳命名并與數(shù)據(jù)庫比對：本文參考人類基因組變異協(xié)會(Human Genome Variation Society,HGVS)所制定的序列變異命名法則(http://www.hgvs.org/mutnomen)；捕獲的遺傳突變與人類基因組突變數(shù)據(jù)庫(HGMD，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)進(jìn)行比對并查詢PubMed上已發(fā)表的文章確定所檢突變是否是新突變。其中EXT2基因中發(fā)現(xiàn)的突變根據(jù)以下參考序列命名：GenBank NM_207122.1 和 GenBank NP_997005。

結(jié) 果

1病人臨床表現(xiàn)

家系1先證者，2歲，X光顯示為左腓骨上段點(diǎn)狀骨疣突起及左股骨下段的點(diǎn)狀骨疣突起，見圖2A、B；家系2先證者，19歲，X光顯示為右橈骨下段條狀骨疣突起及左右股骨下段傘狀骨疣突起，見圖2C、D。

Figure 2.Radiographs of the two probands in the two families.The affected positions were indicated by the arrows.A,B: legs of family 1 proband,showing the dot-like exostoses on the left upper fibula (A) and small supernumerary bone on the distal femur (B); C,D: radiograph of family 2 proband,showing the lower radius growing with the strip exostosis (C) and umbrella protruding bone on the distal femur (D).

2突變篩查結(jié)果

2.1家系1 先證者測序結(jié)果顯示，在EXT1基因的編碼外顯子及其側(cè)翼序列未發(fā)現(xiàn)突變，在EXT2基因發(fā)現(xiàn)1個(gè)已知突變：c.668Ggt;C (p.Arg223Pro),見圖3。

2.2家系2 先證者測序結(jié)果顯示，在EXT1基因的編碼外顯子及其側(cè)翼序列未發(fā)現(xiàn)突變，在EXT2基因發(fā)現(xiàn)1個(gè)新突變：c.950delT (p.Phe317SerfsX15),見圖4C。該突變造成開放閱讀框架的移位，在肽鏈第331位引入終止密碼子，從而使3’端388 個(gè)氨基酸丟失，喪失了編碼蛋白的部分exostosin結(jié)構(gòu)域及全部glyco-transf-64結(jié)構(gòu)域,見圖5。這一突變在人類基因組突變數(shù)據(jù)庫(HGMD，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中未見記錄，故為一新生突變。其父母均不帶有此突變點(diǎn)，見圖4A、B。50個(gè)正常對照中也沒有發(fā)現(xiàn)該突變。

Figure 3.The sequencing result shows the mutation detected in family 1 proband.The arrow denotes the Ggt;C heterozygous change.

Figure 4.The sequencing results show the de novo mutation in family 2.A: the arrow indicates that the mutation was absent in the proband’s father.B: mother of the proband also had no mutation shown by the arrow.C: the de novo mutation was detected in the proband,which was one basepair T deletion causing the frameshift.

Figure 5.Structural model of the wild EXT2 has four domains: signal peptide,transmembrane region,exostosin and glyco_transf-64[13].Arrow denotes the truncating point of the mutant p.Phe317SerfsX15,which would result in the loss of part of the exostosin and the whole glyco-transf-64.

討 論

目前基因突變檢測已普遍應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究[14]。本文對2例多發(fā)性骨軟骨瘤患者進(jìn)行了EXT1和EXT2基因的突變篩查。通過對PCR產(chǎn)物直接測序的方法，在2個(gè)患者中均發(fā)現(xiàn)了EXT2基因的突變，家系1的先證者為1個(gè)已知突變c.668Ggt;C (p.Arg223Pro)，家系2的先證者為1個(gè)新生突變c.950delT (p.Phe317SerfsX15)，數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)檢索證明該突變?yōu)橐粋€(gè)國際上未被報(bào)導(dǎo)的新突變。

p.Arg223Pro使突變位點(diǎn)由精氨酸變成脯氨酸，氨基酸的性質(zhì)發(fā)生了從堿性到非極性疏水性的改變[15]；患者的臨床表型為長骨一端的點(diǎn)狀骨疣。該突變在本課題組先前另一多發(fā)性骨軟骨瘤患者中也有報(bào)道[13]，提示p.Arg223Pro可能為引發(fā)多發(fā)性骨軟骨瘤的突變熱點(diǎn)；p.Phe317SerfsX15使突變位點(diǎn)由苯丙氨酸變成了絲氨酸，氨基酸性質(zhì)從非極性疏水性變?yōu)闃O性中性，并且由于堿基的缺失導(dǎo)致了密碼子的框移，在突變位點(diǎn)后第15個(gè)密碼子處出現(xiàn)終止密碼從而使編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生截?cái)?。根?jù)已報(bào)道文獻(xiàn)中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，c.950delT(p.Phe317SerfsX15)應(yīng)該位于exostosin結(jié)構(gòu)域[13]，其結(jié)果是導(dǎo)致該結(jié)構(gòu)域的部分以及glyco-transf-64結(jié)構(gòu)域的完全丟失，而5’端氨基酸部分(5’ transcript)則會因無義介導(dǎo)的降解(non-sense mediated decay)而降解[16]，最終導(dǎo)致整個(gè)蛋白質(zhì)的功能幾乎完全喪失；該患者的臨床表型為長骨一端的長條狀骨疣，較之家系1先證者的癥狀更加明顯，其父母體格檢查時(shí)未發(fā)現(xiàn)異常，但沒有做相應(yīng)的X-光片檢查，從陰性的突變篩查結(jié)果，可以推測其父母應(yīng)該屬于非患者，同時(shí)也說明該患者的突變是新生突變(denovomutation)，50個(gè)正常對照的篩查也排除了多態(tài)性的可能，因此本研究所發(fā)現(xiàn)的EXT2新生突變是引起多發(fā)性骨軟骨瘤的致病性突變。

至今，報(bào)道的EXT1基因致病突變有200多個(gè)，EXT2基因致病突變有將近100個(gè)，這些突變隨機(jī)分布于整個(gè)基因的前2/3編碼區(qū)[17]。這些突變主要是引起蛋白質(zhì)發(fā)生截?cái)喽虏12]，但在中國患者當(dāng)中由錯(cuò)義突變而致病的現(xiàn)象似乎并不是非常罕見[13]。EXT1和EXT2蛋白都在硫酸乙酰肝素的合成中催化肽鏈的延長[18,19]。EXT1/EXT2所形成的異源低聚復(fù)合物具有的糖基轉(zhuǎn)移酶活性要比單獨(dú)存在的EXT1或EXT2的活性高得多[20]，因此不論是EXT1或者是EXT2的突變都可以影響硫酸乙酰肝素的合成，使正常的骨骼發(fā)育信號受到干擾從而導(dǎo)致骨軟骨瘤的發(fā)生[1]。

總之，本研究對2例多發(fā)性骨軟骨瘤患者進(jìn)行了EXT基因的突變篩查，在EXT2基因中，家系1的先證者檢測到1個(gè)已知突變，家系2的先證者找到1個(gè)新生突變，這一發(fā)現(xiàn)豐富了EXT2基因的致病性突變譜，并為進(jìn)一步探索本病的分子機(jī)制、分子診斷以及表型-基因型的相關(guān)關(guān)系研究提供了有力的數(shù)據(jù)。

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MutationsofEXT2geneinpatientswithmultipleexostoses

ZHONG Liang-ying,DING Hong-ke,YUAN Ping,PEI Yuan-yuan,WANG Yi-ming,HUANG Wei-jun

(DepartmentofMedicalGenetics,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:wonrich@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the mutations ofEXT1 andEXT2 genes in the probands of 2 families with multiple exostoses.METHODSAll coding exons and exon-intron boundaries ofEXT1 andEXT2 genes were amplified by PCR.The PCR products were sequenced.Fifty normal subjects were also sequenced for the novel mutation inEXT2.RESULTSA known mutation c.668Ggt;C (p.Arg223Pro) inEXT2 gene was detected in family 1,the missense mutation replaced arginine with proline at codon 223.A novel mutation c.950delT (p.Phe317SerfsX15) inEXT2 was detected in the proband of family 2.This mutation was undetectable in her parents,indicating adenovomutation.This mutation caused the shift of open reading frame,thus introducing a premature termination and resulting in truncation of the 388 amino acids at the C terminus,wiping out part of the exostosin domain and the whole glyco-transf-64 domain of the protein.CONCLUSIONOur results show that the mutations c.668Ggt;C (p.Arg223Pro) and c.950delT (p.Phe317SerfsX15) inEXT2 gene indicate the molecular mechanism for the development of multiple exostoses in the families.The results can be used for molecular diagnosis.

Exostoses,multiple hereditary; Genes,EXT1; Genes,EXT2;denovomutation

1000-4718(2011)05-0980-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.028

2011-01-10

2011-03-21

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.10151008901000003)

△通訊作者 Tel：020-87332027;E-mail: wonrich96@yahoo.com.cn