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        武漢漢族新生兒中肺表面活性物質(zhì)蛋白D基因多態(tài)性及其與支氣管肺發(fā)育不良相關(guān)性分析*

        2011-11-20 03:39:39周玉容常立文李文斌曾凌空單瑞艷
        中國(guó)病理生理雜志 2011年5期
        關(guān)鍵詞:表面活性等位基因多態(tài)性

        周玉容, 常立文, 李文斌, 劉 偉, 曾凌空, 張 佳, 單瑞艷, 潘 睿

        (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科,湖北 武漢 430030)

        武漢漢族新生兒中肺表面活性物質(zhì)蛋白D基因多態(tài)性及其與支氣管肺發(fā)育不良相關(guān)性分析*

        周玉容, 常立文△, 李文斌, 劉 偉, 曾凌空, 張 佳, 單瑞艷, 潘 睿

        (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科,湖北 武漢 430030)

        目的: 研究武漢漢族新生兒中肺表面活性物質(zhì)蛋白D(SP-D)基因多態(tài)性及其與支氣管肺發(fā)育不良(BPD)易感性的相關(guān)關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)對(duì)218例武漢漢族新生兒SP-D相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)果SP-DMet11Thr三種基因型TT、TC、CC頻率分別為10.5%、49.1%、40.4%,等位基因T和C頻率分別為35.1%和64.9%。SP-DAla160Thr三種基因型GG、GA、AA頻率分別為54.6%、39.4%、6.0%,等位基因G和A頻率分別為74.3%和25.7%。與對(duì)照組比,SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性與BPD發(fā)生率無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(Pgt;0.05)。結(jié)論SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型和等位基因頻率存在種族差異性;SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性與BPD發(fā)生率無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

        肺表面活性物質(zhì)蛋白D; 等位基因; 基因型; 基因多態(tài)性; 支氣管肺發(fā)育不良

        肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant,PS)分布于肺泡液體分子層表面,具有降低肺泡表面張力防止呼氣時(shí)肺泡塌陷的作用。肺表面活性物質(zhì)由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌,它由磷脂和肺表面活性蛋白(surfactant proteins,SPs)組成。肺表面活性物質(zhì)蛋白包括SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。其中SP-D屬于C型凝集素家族,同SP-A一樣是肺組織天然免疫的重要組成部分,而且它可以調(diào)節(jié)肺的炎癥過(guò)程[1]。SP-D除了在肺部炎癥和感染過(guò)程中起重要作用外,它還參與了肺表面蛋白的調(diào)節(jié)過(guò)程[2]。鑒于SP-D在維持肺組織功能方面的作用,它是研究新生兒肺疾病很好的候選基因[3]。SP-D基因研究得較多的是氨基酸殘基11密碼子(SP-DMet11Thr)和氨基酸殘基160密碼子(SP-DAla160Thr)的多態(tài)性[4]。SP-DMet11Thr 多態(tài)性與血清SP-D水平相關(guān)且T等位基因與較高的SP-D水平相關(guān),SP-D水平80%由遺傳因素決定,Met11Thr多態(tài)性在其中起了一半決定作用[5]。SP-D外顯子5上基因多態(tài)性位點(diǎn)SP-DAla160Thr可導(dǎo)致SP-D氨基酸的改變,最新研究證明它的多態(tài)性還與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)[6]。

        支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是長(zhǎng)時(shí)間機(jī)械通氣早產(chǎn)兒的常見(jiàn)病因。近年來(lái)隨著早產(chǎn)兒存活率升高,BPD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。BPD是一種多因素疾病,其本質(zhì)是在遺傳易感性的基礎(chǔ)上,氧中毒、氣壓傷、容量傷以及感染或炎癥等各種不利因素對(duì)發(fā)育不成熟的肺組織所導(dǎo)致的損傷,及其異常修復(fù)[7,8]。本研究以武漢漢族新生兒為研究對(duì)象,探討了武漢新生兒SP-D等位基因頻率分布。同時(shí)采用隨機(jī)病例-對(duì)照研究方法探討了SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性與BPD發(fā)生的關(guān)系。

        材 料 和 方 法

        1研究對(duì)象

        選擇2008年7月至2010年5月就診同濟(jì)醫(yī)院的武漢地區(qū)漢族新生兒218例,其中男138例,女80例。所有符合BPD診斷[8]患兒共32例(男22例,女10例)選為病例組。BPD最重要的流行病因素是小胎齡和低出生體重[9],我們對(duì)BPD胎齡和出生體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)胎齡lt;35周,出生體重均在2 kg以下。因此我們以胎齡﹤35周,出生體重﹤2 kg非BPD患兒64例為對(duì)照組(男48例,女16例),并排除致死性先天畸形、嚴(yán)重的先天性心臟病等疾病。另外對(duì)照組存活均≥28 d。本研究由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得研究對(duì)象父母的知情同意。

        2方法

        2.1標(biāo)本采集及基因組DNA抽提 抽取EDTA或肝素抗凝血0.5 mL,-20 ℃保存,用以提取基因組DNA。DNA抽提采取傳統(tǒng)的酚氯仿抽提法。抽提步驟如下:凍存血自然解凍后加等量磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻,3 000 r·min-1離心15 min;棄上清,加細(xì)胞裂碎液150 μL,37 ℃水浴60 min后加20%十二烷基硫酸鈉(SDS)25 μL和蛋白酶K 20 μL,37 ℃水浴過(guò)夜;次日取消化的細(xì)胞液按3∶1加酚氯仿異戊醇混勻,3 000 r·min-1離心10 min;酚氯仿異戊醇重復(fù)抽提1次;取上層加冰無(wú)水乙醇800 μL和醋酸鈉15 μL使DNA沉淀,70%乙醇洗滌后加TE緩沖液(Tris-EDTA)20 μL溶解DNA;-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)和基因測(cè)序 采用PCR技術(shù),引物設(shè)計(jì)按文獻(xiàn)[10]。引物對(duì)中設(shè)計(jì)了錯(cuò)配堿基(下劃線標(biāo)出,見(jiàn)表1),用以導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系20 μL,含10 μL 2×PCR PLUS MIX(DBI),1.2 μL DNA模板,上、下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共45個(gè)循環(huán)。72 ℃終末循環(huán)10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL分別用FspⅠ(Toyobo)DraⅢ(NEB)酶切,反應(yīng)體系15 μL,含F(xiàn)spⅠ、DraⅢ酶各4 U、5 U,37 ℃消化過(guò)夜。取5 μL酶消化產(chǎn)物和3 μL 6×上樣緩沖液進(jìn)行瓊脂糖凝膠(濃度3%)電泳分離,紫外光下觀察并照相。參照DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa DL500 DNA marker)根據(jù)電泳條帶位置判斷基因型。上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物隨機(jī)抽取部分送華大基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序引物由華大基因設(shè)計(jì),見(jiàn)表1。

        表1 SP-D引物序列、限制性內(nèi)切酶和酶切后片段長(zhǎng)度及測(cè)序引物

        3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        通過(guò)基因型頻率計(jì)算等位基因頻率,以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)樣本的群體代表性。武漢新生兒基因型以及基因頻率分布的比較采用Pearson2檢驗(yàn)。BPD組與對(duì)照組基因型及等位基因頻率比較分別用Fisher確切概率法。Plt;0.05 為顯著差異。Hardy-Wenberg平衡檢驗(yàn)、基因頻率、等位基因頻率比較用Popgene 1.31統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。其它數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 11.5 for Windows 統(tǒng)計(jì)軟件。

        結(jié) 果

        1SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因分型

        SP-DMet11Thr基因經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為139 bp。經(jīng)FspⅠ酶切后產(chǎn)生3種基因型,其基因型和對(duì)應(yīng)酶切后長(zhǎng)度為: CC(139 bp)、TC (107 bp、139 bp)和 TT(107 bp)。SP-DAla160Thr基因經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為161 bp。經(jīng)DraⅢ酶切后產(chǎn)生 3 種基因型,其基因型和對(duì)應(yīng)酶切后長(zhǎng)度為: GG(161 bp)、GA(132 bp、161 bp)、AA(132 bp)。PCR-RFLP檢測(cè)SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因分型結(jié)果與直接DNA測(cè)序結(jié)果完全吻合。

        2武漢漢族新生兒SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型及等位基因頻率分布

        選擇2008年7月至2010年5月就診同濟(jì)醫(yī)院的武漢地區(qū)漢族新生兒218例進(jìn)行基因型的檢測(cè)。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)人群基因型達(dá)到遺傳平衡(Pgt;0.05),具有群體代表性。SP-DMet11Thr三種基因型TT、TC、CC頻率分別為10.5 %、49.1 %、40.4 %,等位基因T頻率為35.1 %,等位基因C頻率為64.9 %。SP-DAla160Thr三種基因型GG、GA、AA頻率分別為54.6 %、39.4 %、6.0 %,等位基因G頻率74.3 %,等位基因A頻率25.7 %。

        3不同國(guó)家地區(qū)SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性分布的比較

        我們比較了不同國(guó)家SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型和等位基因頻率。SP-DMet11Thr等位基因T頻率德國(guó)人為62.2 %[4],墨西哥人為61.0 %[11],日本人為41.2 %[6],漢族新生兒(本例對(duì)照)為34.0 %。SP-DAla160Thr等位基因G在德國(guó)人為40.0 %[4],墨西哥人為60.0%[11],日本人為68.4 %[6],而中國(guó)人為80.0 %。不同國(guó)家SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)本研究對(duì)照組基因型頻率與日本人較接近。武漢新生兒與其他3種群基因型及等位基因頻率Pearson2檢驗(yàn)顯示:武漢新生兒等位基因頻率與德國(guó)人、墨西哥人及日本人相比有顯著差異(Plt;0.05);武漢新生兒基因型頻率與德國(guó)人和墨西哥人相比有顯著差異(Plt;0.05),與日本人比差異不明顯(Pgt;0.05)。

        4SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr多態(tài)性與BPD發(fā)生的關(guān)系

        BPD與對(duì)照組在性別構(gòu)成、胎齡、出生體重等方面無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)。SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型頻率和等位基因頻率在BPD和對(duì)照組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05),見(jiàn)表3。

        表3 BPD組和對(duì)照組SP-D Met11Thr 和SP-D Ala160Thr基因型及等位基因頻率分布

        討 論

        編碼SP-D的基因位于人類10號(hào)染色體的長(zhǎng)臂q22.2-23.1區(qū)域,編碼SPA的基因也位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂上。本文研究的多態(tài)性位點(diǎn)SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr在SP-D氨基酸末端和膠原結(jié)合區(qū)域。

        我們對(duì)不同國(guó)家地區(qū)SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性的比較結(jié)果,進(jìn)一步證實(shí)SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型和等位基因頻率存在種族差異性。大部分關(guān)于SP-D基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性主要在肺部疾病方面,尤其是肺部感染。眾多嚴(yán)重慢性和炎癥性肺部疾病存在SP-D血清水平升高現(xiàn)象,如間質(zhì)性肺炎、特發(fā)性肺纖維化、肺泡蛋白沉積癥、嗜酸性肺炎、急性呼吸窘迫綜合癥和囊性纖維化等[10,12]。已證實(shí)SP-DThr11等位基因是結(jié)核病的易感基因[13],在此位點(diǎn)上的另一個(gè)等位基因SP-DMet11與嚴(yán)重呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎相關(guān)[11]。研究SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因多態(tài)性種族差異性有利于了解某些疾病(尤其是SP-D相關(guān)性疾病)在某些種族中的易感性,從而有利于采取針對(duì)性的預(yù)防措施并最終找到治療方法(如基因治療,其已在積極研究中[14])。

        而關(guān)于SP-D基因多態(tài)性與BPD關(guān)聯(lián)研究較少,目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)此類報(bào)道。國(guó)外有家系研究顯示單倍體型SPD-160(G)SPA2(1A2)和SPD-11(C)160(G)SPA2(1A2)是BPD保護(hù)性基因[15]。本研究結(jié)果顯示SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型頻率和等位基因頻率在BPD和對(duì)照組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。鑒于本研究樣本量較小,且SP-D基因存在種族或地域差異性,本研究并不能完全確定SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr與BPD發(fā)生無(wú)關(guān)。因此下一步有必要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究,如有條件還可采用更加嚴(yán)格的家系或雙胎研究分析,以進(jìn)一步明確SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr多態(tài)性與BPD的發(fā)生之間是否存在相關(guān)。

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        PolymorphismsofsurfactantproteinDandassociationbetweenpolymorphismsandbronchopulmonarydysplasiainHanracialWuhannewborns

        ZHOU Yu-rong,CHANG Li-wen,LI Wen-bin,LIU Wei,ZENG Ling-kong,ZHANG Jia,SHAN Rui-yan,PAN Rui

        (DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:lwchang@tjh.tjmu.edu.cn)

        AIM: To analyze the genetic polymorphisms of surfactant protein D (SP-D) and to investigate the association between polymorphisms and bronchopulmonary dysplasia (BPD) in Han racial Wuhan newborns.METHODSGenotyping ofSP-Dpolymorphisms was performed by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis (PCR-RFLP) in 218 Han racial Wuhan newborns.The method of gene sequencing was used to validate the results.RESULTSThe frequencies of TT,TC,CC ofSP-DMet11Thr were 10.5%,49.1% and 40.4%,respectively,and the allele frequencies of T and C were 35.1% and 64.9%,respectively.The frequencies of GG,GA,AA ofSP-DAla160Thr were 54.6%,39.4% and 6.0%,respectively,and the allele frequencies of G and A were 74.3% and 25.7%.SP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr displayed no significant association with BPD as compared with control group.CONCLUSIONThe differences inSP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr polymorphisms are significant among several ethnic groups.Polymorphisms ofSP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr display no significant association with BPD as compared with control group.

        Pulmonary surfactant-associated protein D; Alleles; Genotype; Gene polymorphism; Bronchopulmonary dysplasia

        1000-4718(2011)05-0968-04

        R363; R722

        A

        10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.025

        2010-11-23

        2011-02-20

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30872795);湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2008CDB139);新教師基金資助項(xiàng)目(高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金,No.200804871058)

        △ 通訊作者 Tel:027-83663345;E-mail:lwchang@tjh.tjmu.edu.cn

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