席 瓊， 胡巢鳳， 張 蕓， 陸大祥， 蔣 宇

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，國家中醫(yī)藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

RIP2對大腸桿菌的抗菌作用研究*

席 瓊， 胡巢鳳△， 張 蕓， 陸大祥， 蔣 宇

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，國家中醫(yī)藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

目的： 探討受體相互作用蛋白2(RIP2)對人腸細胞清除大腸桿菌的作用。方法使用陽離子聚合物JetPeiTM介導(dǎo)人RIP2基因(pEGFP-C2-PIP2)轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細胞株，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及未轉(zhuǎn)染的SW480細胞株作為對照，應(yīng)用RT-PCR檢測外源性RIP2 mRNA水平的變化、Western blotting法檢測細胞RIP2蛋白的表達；并利用大腸桿菌ATCC25922感染轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的SW480細胞24 h,用平板培養(yǎng)菌落計數(shù)活菌數(shù)。應(yīng)用p38 MAPK通路抑制劑SB203580作用于3組細胞，計數(shù)活菌數(shù)。結(jié)果與對照組相比，轉(zhuǎn)染RIP2組其mRNA和蛋白表達水平均有明顯升高(Plt;0.01,Plt;0.05)，表明RIP2表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染SW480細胞。轉(zhuǎn)染RIP2細胞能清除胞內(nèi)大腸桿菌；而阻斷p38 MAPK信號通路后，RIP2清除胞內(nèi)大腸桿菌的作用被阻斷。結(jié)論RIP2轉(zhuǎn)染細胞可有效清除胞內(nèi)大腸桿菌，這種胞內(nèi)細菌的清除作用可能與p38 MAPK信號通路有關(guān)。這些結(jié)果提示RIP2在細菌感染性疾病治療中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

受體相互作用蛋白2； 基因轉(zhuǎn)染； 抗菌作用

受體相互作用蛋白2(receptor-interacing protein 2,RIP2)，也稱為RIPK2、RICK或CARDIAK，是RIP激酶家族的成員，其基因全長1 623 bp，表達61 kD蛋白，在多種組織中均有分布。RIP2的 N-末端包含有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域， C-末端含caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain,CARD)，可與多種蛋白相互作用，發(fā)揮其生理功能。RIP2參與固有免疫和獲得性免疫中多個受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]，被認為是固有免疫和特異性免疫信號途徑的重要銜接分子，在免疫及炎癥反應(yīng)中起重要作用。

固有免疫系統(tǒng)通過免疫識別模式受體(pattern-recognition receptors,PRRs)識別入侵的病原體，其主要包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)家族和NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs )家族，而RIP2是NLRs的下游因子，激活后能啟動下游分子級聯(lián)反應(yīng)，銜接NLRs并激活NF-κB (nuclear factor-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]，引起宿主的天然和獲得性免疫反應(yīng)，在先天性免疫反應(yīng)和清除病原感染的炎癥反應(yīng)中起著重要作用。對RIP2的研究可以加深我們對細胞內(nèi)外模式識別受體參與免疫應(yīng)答和炎癥防御機制的認識。本實驗選擇大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli) 為入侵病原體，利用轉(zhuǎn)染RIP2基因觀察其表達情況，同時將轉(zhuǎn)染細胞與大腸桿菌共同孵育，觀察RIP2對大腸桿菌的作用，并初步探討其作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

質(zhì)粒pEGFP-C2為本室保存；pEGFP-C2-RIP2真核表達質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建，經(jīng)酶切及測序鑒定后保存在本實驗室。大腸桿菌ATCC25922由暨南大學(xué)附屬華僑醫(yī)院檢驗科惠贈。人結(jié)腸癌細胞系SW480由暨南大學(xué)病理教研室惠贈。細胞轉(zhuǎn)染所用的陽離子聚合物JetPEITM為Polyplus產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)基DMEM為Gibco產(chǎn)品；胎牛血清購自Hyclone；細胞培養(yǎng)板為Corning Costar產(chǎn)品；Trizol、MMLV reverse transcriptase試劑盒購自Invitrogen；PCR試劑盒購自TaKaRa；BCA蛋白質(zhì)定量測定試劑盒為上海申能博彩生物公司產(chǎn)品；兔抗人RIP2多抗購自Santa Cruz，羊抗兔IgG抗體購自博士德生物公司；Triton X-100購自Sigma；p38 MAPK抑制劑SB203580購自Promega。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

2細胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞

SW480細胞采用DMEM高糖培養(yǎng)液，加入10％的胎牛血清及0.1 g/L青霉素和鏈霉素，在37 ℃、5％的CO2條件下進行細胞培養(yǎng)及傳代。SW480細胞按5×108cells/L分別接種于6孔板內(nèi)，待細胞生長至80％融合時進行轉(zhuǎn)染。將2 μg質(zhì)粒DNA稀釋于150 μL濃度為0.15 mol/L的NaCl中(DNA溶液)；4 μL JetPEITM稀釋于150 μL濃度為0.15 mol/L NaCl中(JetPEITM溶液)，充分混勻后將JetPEITM溶液加入DNA溶液中，將該JetPEITM/DNA復(fù)合物在室溫下孵育20 min后加入培養(yǎng)SW480細胞的6孔板，輕搖混勻,置于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。48 h后將轉(zhuǎn)染的SW480細胞置于Olympus BX-51倒置熒光顯微鏡下，用488 nm波長紫外光激發(fā),發(fā)射光波長為507 nm觀察細胞中綠色熒光的表達。

3RT-PCR法檢測RIP2的mRNA表達

實驗分組：(1) pEGFP-C2-RIP2轉(zhuǎn)染組；(2) pEGFP-C2轉(zhuǎn)染組；(3)未轉(zhuǎn)染組。按Trizol試劑盒說明書抽提細胞總RNA，以1 μg RNA為模板，按照MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA；根據(jù)GenBank資料設(shè)計RIP2引物如下：上游5’-TCCCTACCACAAACTCGCC-3’；下游5’- GCATCCTTTCTTTCACTGTCG-3’(擴增產(chǎn)物150 bp)；以GAPDH(上游5’- CCAATATGATACCACCCATG-3’,下游5’- AGGTCCACCACTGACACGTT-3’，擴增產(chǎn)物為594 bp)為內(nèi)參照進行PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)條件:98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上成像及灰度分析，分析目的條帶與相應(yīng)的GAPDH條帶灰度比值。

4Western蛋白印跡檢測RIP2蛋白表達

實驗分組如前。收集轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的SW480細胞5×106cells,培養(yǎng)細胞用冰冷PBS洗3次后，加入PMSF裂解緩沖液。冰浴30 min后將裂解物以12 000×g離心5 min，收集上清。Bradford法檢測蛋白質(zhì)的含量。在SDS-PAGE(5％濃縮膠，10％分離膠)上進行分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維(PVDF)薄膜上。5％ 脫脂牛奶封閉2 h后，將PVDF膜與兔抗人RIP2多抗4 ℃過夜孵育。洗膜3次后與生物素標(biāo)記的抗兔IgG抗體室溫孵育1 h。最后用ECL試劑檢測結(jié)果,并曝光于X光片上。Bio-Rad圖像分析儀分析目的蛋白條帶與相應(yīng)的GAPDH條帶相對灰度比值。

5細菌培養(yǎng)及計數(shù)

挑取ATCC25922單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、150 r/min振搖培養(yǎng)4 h，取100 μL菌液至LB固體培養(yǎng)板，37 ℃孵箱培養(yǎng)過夜，24 h后收集細菌至離心管，10 000 r/min離心5 min收集細菌沉淀，將細菌重懸于無菌生理鹽水，利用分光光度計測定菌液A值(600 nm)，用平板記數(shù)法檢測最終培養(yǎng)濃度。再以已知菌濃度的菌液A值為橫坐標(biāo)，以細菌濃度為縱坐標(biāo)，建立細菌數(shù)與A值關(guān)系曲線，獲得直線回歸方程[3]，從而確定細菌感染濃度。

6大腸桿菌胞內(nèi)活菌數(shù)量的測定

大腸桿菌按上法定量至4×1010CFU/L。按常規(guī)培養(yǎng)SW480細胞，將濃度調(diào)至4×108cells/L,每孔加0.1 mL于48孔培養(yǎng)板,待細胞貼壁生長至80％，棄去培養(yǎng)孔中的液體，每孔加入0.1 mL菌液，37 ℃共同作用2 h后棄去菌液并用PBS洗3次以去除未黏附的細菌。再將每孔加入含有10％胎牛血清、100 mg/L慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基300 μL(慶大霉素不進入細胞內(nèi)，只殺死胞外細菌)，置于37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中孵育以殺死細胞外細菌。分別于實驗4、24和36h后每孔加入Triton X-100裂解細胞15 min,漩渦振蕩后將裂解液作10倍系列稀釋，每個稀釋度取100 μL涂布LB平板(每個稀釋度取涂2塊板)，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌落形成單位(CFU)數(shù)量,計算出每孔細胞內(nèi)的活菌數(shù)量。

7各組細胞對大腸桿菌胞內(nèi)清除作用的檢測

實驗分3組：(1) pEGFP-C2-RIP2轉(zhuǎn)染細胞+細菌；(2) pEGFP-C2轉(zhuǎn)染細胞+細菌；(3)未轉(zhuǎn)染細胞+細菌。將以上分組細胞以4×104cells接種于48孔板，實驗方法如前所述，在細菌感染細胞后的24 h用Triton X-100裂解細胞15 min，漩渦振蕩后將裂解液作10倍系列稀釋，每個稀釋度取100μL涂布LB平板(每個稀釋度取涂2塊板)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)，24 h后計數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)。

8SB203580對各組細胞感染大腸桿菌的影響

實驗分6組：(1)pEGFP-C2-RIP2轉(zhuǎn)染細胞+細菌+SB203580；(2)pEGFP-C2-RIP2轉(zhuǎn)染細胞+細菌；(3)pEGFP-C2轉(zhuǎn)染細胞+細菌+SB203580；(4)pEGFP-C2轉(zhuǎn)染細胞+細菌；(5)未轉(zhuǎn)染細胞+細菌+SB203580;(6)未轉(zhuǎn)染細胞+細菌。細菌感染前用10 μmol/L的SB203580刺激細胞2 h，之后加入細菌共孵育，方法如前述。24 h后計數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)。

9統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1RIP2mRNA在人結(jié)腸癌細胞株SW480中的表達

pEGFP-C2-RIP2和pEGFP-C2轉(zhuǎn)染細胞48 h后，多數(shù)細胞胞漿區(qū)可觀察到綠色熒光蛋白的表達，未轉(zhuǎn)染組無綠色熒光蛋白表達。RIP2 mRNA片段為150 bp,內(nèi)參照GAPDH片段為594 bp,見圖1，擴增產(chǎn)物與預(yù)計一致。pEGFP-C2-RIP2轉(zhuǎn)染細胞組RIP2 mRNA的含量較pEGFP-C2轉(zhuǎn)染細胞組和未轉(zhuǎn)染細胞組明顯增高，組間比較差異顯著(Plt;0.01)。而pEGFP-C2轉(zhuǎn)染細胞組和未轉(zhuǎn)染細胞組之間RIP2 mRNA表達無顯著差異(Pgt;0.05),見圖1。

2RIP2蛋白在SW480細胞中的表達

Western blotting結(jié)果顯示，在61 kD處有明顯的特異性蛋白條帶,與RIP2蛋白的分子量相符。pEGFP-C2-RIP2轉(zhuǎn)染細胞組RIP2 蛋白表達較pEGFP-C2轉(zhuǎn)染細胞組和未轉(zhuǎn)染細胞組明顯增高(Plt;0.05)。而pEGFP-C2轉(zhuǎn)染細胞組和未轉(zhuǎn)染細胞組之間RIP2 蛋白表達無顯著差異(Pgt;0.05),見圖2。

Figure 1.RIP2 mRNA expression in SW480 cells detected by RT-PCR.Marker：2 000 bp DNA marker；1: SW480 cells transfected with pEGFP- C2-RIP2；2: SW480 cells transfected with pEGFP- C2；3: SW480 cells without transfection.±s.n=3.**Plt;0.01 vs 2 and 3.

Figure 2.RIP2 protein expression in SW480 cells detected by Western blotting.1: SW480 cells transfected with pEGFP- C2-RIP2；2: SW480 cells transfected with pEGFP- C2；3: SW480 cells without transfection±s.n=3.*Plt;0.05 vs 2 and 3.

3大腸桿菌細菌數(shù)與A值的關(guān)系

以已知菌濃度的菌液A值為橫坐標(biāo)，以細菌濃度為縱坐標(biāo)，建立細菌數(shù)與A值關(guān)系曲線,得到該菌的回歸方程：細菌數(shù)Y=14.362X-0.052,見圖3。用此方程可計算細菌感染濃度。本研究選擇細菌感染濃度為4×1010CFU/L，每孔加入0.1 mL菌液。

Figure 3.The relationship curve between A value and bacterial number of E.coli.

4大腸桿菌胞內(nèi)生長曲線

實驗結(jié)果表明,隨感染時間延長(4 h、24 h、36 h),SW480細胞內(nèi)大腸桿菌數(shù)量不斷增加，見圖4。本研究選擇大腸桿菌在細胞內(nèi)感染時間為24 h。

Figure 4.The growth curve of E.coli in SW480 cells.

5轉(zhuǎn)染RIP2后細胞對大腸桿菌的清除作用

pEGFP- C2-RIP2組胞內(nèi)細菌數(shù)量為(1.14×1010±1.1×108)CFU/L，明顯低于pEGFP- C2 轉(zhuǎn)染組(1.63×1010±0.44×108)CFU/L和未轉(zhuǎn)染組(1.62×1010±0.33×108)CFU/L(Plt;0.01),提示RIP2轉(zhuǎn)染細胞可以清除胞內(nèi)大腸桿菌,見圖5。

6SB203580對RIP2抗菌作用的影響

pEGFP- C2-RIP2組細菌數(shù)量明顯低于pEGFP- C2 轉(zhuǎn)染組(Plt;0.01)，而加入SB203580后pEGFP- C2-RIP2組細胞內(nèi)細菌數(shù)明顯增加，與pEGFP- C2 轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較無顯著差別(Pgt;0.05)，提示p38 MAPK 抑制劑SB203580能阻斷RIP2清除胞內(nèi)大腸桿菌的作用，見圖6。

Figure 5.Comparison of the intracellular viable count of E.coli in SW480 cells.1: SW480 cells transfected with pEGFP- C2-RIP2；2: SW480 cells transfected with pEGFP- C2；3: SW480 cells without transfection±s.n=6.**Plt;0.01 vs 2 and 3.

Figure 6.Effect of SB203580 on the intracellular viable count of E.coli in SW480 cells.1: SW480 cells transfected with pEGFP- C2-RIP2；2: SW480 cells transfected with pEGFP- C2；3: SW480 cells without transfection±s.n=6.**Plt;0.01 vs other groups.

討 論

大腸桿菌是致病性革蘭氏陰性腸道菌，其胞壁上的肽聚糖在感染時可被宿主NLRs識別，通過RIP2信號分子激活細胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB轉(zhuǎn)錄，表達炎性細胞因子，引發(fā)宿主的固有免疫應(yīng)答[4]。在黏膜表面上皮細胞(如結(jié)腸上皮細胞)，由于細胞不斷與菌叢接觸，TLRs表達下調(diào)，以避免PAMPs對細胞的刺激導(dǎo)致這些組織的異常炎癥反應(yīng)。當(dāng)這些細胞感染了病原體，PAMPs可轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，與NOD蛋白相互作用，啟動防御反應(yīng)[5]，NOD 的寡聚化誘導(dǎo)了 RIP2 蛋白并導(dǎo)致 NF-κB 的活化，因此，RIP2在抵御病原體入侵過程中發(fā)揮了重要作用。RIP2基因位于8q21,編碼RIP2蛋白，在脾臟、外周血白細胞、胎盤等組織中呈現(xiàn)高表達。研究發(fā)現(xiàn)，RIP2缺陷型巨噬細胞游走延遲，細胞內(nèi)感染增加，臨床病程遷移；相反早期RIP2表達上調(diào)往往臨床預(yù)后較好[6]。

近年來發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路參與細胞的生長發(fā)育及細胞間功能同步等多種生理過程，它通過磷酸化下游激酶和轉(zhuǎn)錄因子而參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)和成功克隆了細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases,ERKs)、應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinases,SAPK,又稱JNK)和p38 MAPK 3個MAPK亞族。其中p38 MAPK主要參與炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)，還參與細胞增殖、凋亡和分化[8]。各種細胞外信號包括細菌、活性氧、細胞因子、紫外線照射、高滲狀態(tài)等均能激活p38 MAPK。p38激活后可趨化和活化白細胞、激活單核-巨噬細胞系統(tǒng)，在人體屏障功能中起重要作用。p38 MAPK特異性抑制劑SB203580(吡啶異噠唑衍生物)競爭性結(jié)合p38 MAPK的ATP位點，可阻止p38 MAPK激活下游底物[9]，從而阻斷p38 MAPK的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并可減少或阻斷多種炎癥介質(zhì)。SB203580活性的IC50大約為0.5 μmol/L[10]，并存在劑量依賴(0.1-10 μmol/L)，最強的抑制作用發(fā)生在10 μmol/L時[11]。

腸道感染是臨床實踐中最常見的細菌感染之一，宿主多種防御機制和抗生素治療可有效殺滅腸道細菌，本研究發(fā)現(xiàn)，將構(gòu)建的RIP2基因轉(zhuǎn)染至腸道細胞后，RT-PCR和Western blotting檢測分別證實了其mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平明顯增加；在大腸桿菌感染腸道細胞后，隨著時間的增長，其胞內(nèi)菌也隨之增長。而將大腸桿菌感染轉(zhuǎn)染RIP2的細胞，發(fā)現(xiàn)細胞胞內(nèi)菌數(shù)量明顯減少，與未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比具有顯著差異，說明RIP2對大腸桿菌有明顯的抑制作用；而加入p38 MAPK通路抑制劑SB203580，則其清除胞內(nèi)大腸桿菌的作用被阻斷，說明RIP2的抗菌作用可能與p38 MAPK信號通路有關(guān)。隨著對NLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的深入研究，RIP2可作為腸道細菌感染治療的新靶點，將有助于預(yù)防和治療感染性疾病。

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ExpressionofRIP2enhancesclearanceofintracellularEscherichiacoliinSW480cells

XI Qiong,HU Chao-feng,ZHANG Yun,LU Da-xiang,JIANG Yu

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thcf@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the clearance effect and mechanism of high expression of receptor-interacting protein 2 (RIP2) againstEscherichiacoli(E.coli) in intestinal cells.METHODSRIP2 gene (pEGFP-C2-PIP2) was transfected into cell line SW480 by the method of JetPeiTM.Western blotting and RT-PCR analysis were then used to detect RIP2 protein and mRNA expression,respectively.The transfected and non-transfected cells were incubated withE.coliat 37 ℃.At 24 h after initial incubation,the viable intracellular bacteria were quantified by plating appropriate dilution on LB agar plates.The transfected and non-transfected cells were treated with SB203580,an inhibitor of p38 MAPK pathway,and the changes of intracellular bacteria were also quantified.RESULTSCompared with the cells transfected with pEGFP-C2 and non-transfected cells,the expression of RIP2 at mRNA and protein levels was significantly enhanced in SW480 cells transfected with recombinant plasmid pEGFP-C2-PIP2 (Plt;0.01 andPlt;0.05,respectively).The cells transfected with pEGFP-C2-PIP2 had the ability to clear invadingE.coli,and this antibacterial effect was inhibited by a p38 MAPK inhibitor SB203580.CONCLUSIONRIP2 effectively eliminates the invadingE.coli,and p38 MAPK pathway plays an important role in the clearance effect of RIP2,indicating that RIP2 may be a potential molecular therapeutic target for infectious disease.

Receptor-interacting protein 2; Gene transfection; Antibacterial effect

1000-4718(2011)05-0951-05

R392.11

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.022

2011-01-06

2011-03-04

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.06025159)；廣東省教育廳自然科學(xué)研究項目[No.粵財教(2005)126]；暨南大學(xué)“211工程”三期預(yù)研項目；暨南大學(xué)重點實驗室基金資助項目

△通訊作者 Tel: 020-85228079；E -mail：thcf@jnu.edu.cn