婁遠(yuǎn)蕾， 劉 芬， 高法梁， 阮瓊芳， 崔蘇萍， 鄧志鋒△， 汪 泱△

(南昌大學(xué)1第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所，2第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 南昌 330006)

miR-210對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF-Notch信號(hào)通路的調(diào)控*

婁遠(yuǎn)蕾1▲， 劉 芬1▲， 高法梁2， 阮瓊芳1， 崔蘇萍1， 鄧志鋒2△， 汪 泱1△

(南昌大學(xué)1第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所，2第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 南昌 330006)

目的： 觀(guān)察過(guò)表達(dá)miR-210對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-Notch信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響，探討miR-210調(diào)控血管新生的分子機(jī)制。方法采用常規(guī)方法培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVE-12)。通過(guò)轉(zhuǎn)染LV- miR-210-GFP重組慢病毒載體上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞miR-210表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分為miR-210過(guò)表達(dá)組(LV- miR-210-GFP)和對(duì)照組(LV-GFP)。采用real-time PCR檢測(cè)miR-210的表達(dá)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ephrin-A3的表達(dá)，采用real-time PCR、Western blotting、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法分別檢測(cè)VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)分子VEGF、VEGF 2(VEGFR 2)、Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-210過(guò)表達(dá)組miR-210表達(dá)水平上調(diào)了(32.10±1.26)倍；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，miR-210過(guò)表達(dá)組陽(yáng)性細(xì)胞率[(73.22±1.45)％]較對(duì)照組[(12.52±0.67)％]明顯增加(Plt;0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-210過(guò)表達(dá)組 VEGF、VEGFR2、Notch1 mRNA分別較對(duì)照組上調(diào)了(7.40±0.67)、(2.50±0.10)、(9.70±0.72)倍,Plt;0.05；免疫熒光結(jié)果顯示，miR-210過(guò)表達(dá)組VEGF和VEGFR2紅色熒光信號(hào)均顯著強(qiáng)于對(duì)照組(Plt;0.05)。Western blotting 結(jié)果顯示，miR-210過(guò)表達(dá)組血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch1的蛋白表達(dá)量(4.22±0.60)較對(duì)照組明顯升高(Plt;0.05)。結(jié)論miR-210過(guò)表達(dá)可顯著上調(diào)VEGF-Notch信號(hào)通路分子的表達(dá)水平。

miR-210； 血管內(nèi)皮細(xì)胞； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； Notch1

缺血性損傷是器官衰竭的主要誘因，盡快促進(jìn)血管新生、恢復(fù)有效血供是修復(fù)損傷的關(guān)鍵。血管新生受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，主要是一些促血管生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)家族、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管生成素、內(nèi)皮素-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α等，其中VEGF是重要的調(diào)控因子[1-3]。研究表明，VEGF可誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上Notch1 的表達(dá)，參與新生血管的形成[4]。但VEGF-Notch信號(hào)通路的上游調(diào)控因子仍所知甚少。微小RNA(microRNA,miRNA)對(duì)血管新生亦有重要的調(diào)控作用。研究報(bào)道，miR-210是缺氧誘導(dǎo)miRNA，在缺氧條件下，miR-210在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，并能促進(jìn)毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成及細(xì)胞遷移[5]。生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-210可調(diào)控VEGF[6]，然而miR-210對(duì)血管新生可能的調(diào)控途徑及機(jī)制尚不清楚。

為進(jìn)一步探討miR-210調(diào)控血管新生的機(jī)制，本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-210，觀(guān)察VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的變化，以明確miR-210對(duì)VEGF-Notch信號(hào)通路的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVE-12)購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司。

1.2主要試劑 Trizol reagent(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)；PE標(biāo)記Ⅱ抗(Abcam)；VEGF抗體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)抗體、Notch1抗體、ephrin-A3抗體和羅丹明標(biāo)記Ⅱ抗均購(gòu)自Santa Cruz。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 以1×109/L HUVE-12細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，在含15％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中置于37 ℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，隔天換液。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)呈鵝卵石樣；細(xì)胞增殖至約80％融合時(shí)，0.25％EDTA胰蛋白酶消化傳代。

2.2重組慢病毒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 針對(duì)目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)合適的PCR引物；將合成的2條引物，進(jìn)行退火，將目標(biāo)載體與引物退火產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切。將純化回收的酶切產(chǎn)物進(jìn)行定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行PCR鑒定，其上、下游引物都設(shè)計(jì)在載體上，PCR鑒定為陽(yáng)性克隆，證明目的片段已經(jīng)定向連入目的載體。再對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序和分析比對(duì)，比對(duì)正確的即為構(gòu)建成功的質(zhì)粒載體。

轉(zhuǎn)染前24 h以3.0×108/L密度將內(nèi)皮細(xì)胞種至6孔板。以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為10加入0.75 μL病毒原液(終濃度為3.0×109cell/L)，每孔中加入Polybrene，終濃度為5 mg/L。轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀(guān)察GFP綠色熒光，估算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)分為miR-210過(guò)表達(dá)組(LV- miR-210-GFP轉(zhuǎn)染組)與對(duì)照組(LV-GFP轉(zhuǎn)染組)。

2.3實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)miR-210及VEGF、VEGFR2、Notch1基因的表達(dá)變化 轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，采用Trizol法抽提總RNA，核酸測(cè)定儀測(cè)A260/A280，要求在1.8-2.0之間，同時(shí)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量。參考文獻(xiàn)[7]，采用stem-loop引物進(jìn)行miR-210逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件如下：16 ℃ 30 min,30 ℃,30 s,42 ℃,30 s,50 ℃,1 s,共60個(gè)循環(huán)；70 ℃ 15 min。以U6為內(nèi)參照。普通基因表達(dá)檢測(cè)以GAPDH為內(nèi)參照。采用SYBR Green I qPCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)系統(tǒng)為ABI 7500 real-time PCR system，反應(yīng)條件如下：95℃,10 min,95 ℃,15 s,60 ℃,30 s，40個(gè)循環(huán)。最后行融解曲線(xiàn)分析。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)管，同時(shí)設(shè)無(wú)模板陰性對(duì)照?；虮磉_(dá)的相對(duì)變化以2-ΔΔCt表示。

2.4流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)ephrin-A3表達(dá)變化 消化細(xì)胞，調(diào)整密度為2.5×105cells/50 μL的PBS細(xì)胞懸液，加入多聚甲醛固定，加入Ⅰ抗2.5 μL，加入PE標(biāo)記的Ⅱ抗1 μL，避光保存待上機(jī)檢測(cè)。

2.5免疫熒光染色法檢測(cè)VEGF和VEGFR2的表達(dá)變化 將細(xì)胞種植在蓋玻片上，約生長(zhǎng)密度在60％取出。以1％牛血清白蛋白封閉，加Ⅰ抗(1∶100)，37 ℃孵育2 h，加Ⅱ抗(1∶200)，37 ℃下避光反應(yīng)50 min，DAPI染色5 min，50％甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照。每張蓋玻片選取5個(gè)不重疊的視野于同一曝光度下拍照，采用Image J軟件半定量比較兩組紅色熒光吸光度平均值。

2.6Western blotting檢測(cè)Notch1的表達(dá)變化 收集內(nèi)皮細(xì)胞，按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白上樣，PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜2 h，5％脫脂奶粉室溫封閉1 h。加Ⅰ抗(1∶1 000大鼠抗人Notch1)，37 ℃孵育2 h，TBST緩沖液洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，BST緩沖液洗膜，ECL試劑顯影。以β-actin蛋白作為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞后miR-210表達(dá)水平明顯上調(diào)

重組慢病毒轉(zhuǎn)染至HUVE-12后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光，GFP陽(yáng)性率在80％以上。Real-time PCR 結(jié)果顯示，LV- miR-210-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，miR-210上調(diào)了(32.10±1.26)倍,Plt;0.05,見(jiàn)圖1。這表明LV- miR-210-GFP的重組慢病毒轉(zhuǎn)染可過(guò)表達(dá)miR-210。

2miR-210可抑制內(nèi)皮細(xì)胞ephrin-A3的表達(dá)

流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示，miR-210過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組ephrin-A3陽(yáng)性細(xì)胞率分別為(12.52±0.67)％和(73.22±1.45)％，miR-210轉(zhuǎn)染后ephrin-A3陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，Plt;0.05,見(jiàn)圖2。這表明miR-210的上調(diào)可抑制其靶基因ephrin-A3的蛋白表達(dá)。

Figure 1.MiR-210 overexpression in HUVE-12 cells.miR-210 expression was significantly up-regulated after LV-miR-210-GFP transfection±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV-GFP group.

Figure 2.The expression of ephrin-A3 protein after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.Flow cytometry analysis showed that ephrin-A3 protein was down-regulated compared to LV-GFP group;A:LV-GFP group;B: LV- miR-210-GFP group; C：percentage of ephrin-A3-positive cells .±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV-GFP group.

3miR-210可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、VEGFR2、Notch1mRNA的表達(dá)

Real-time PCR 結(jié)果顯示，miR-210過(guò)表達(dá)后， VEGF、VEGFR2、Notch1較對(duì)照組分別上調(diào)了(7.40±0.67)倍、(2.50±0.10)倍、(9.70±0.72)倍,Plt;0.05,見(jiàn)圖3。表明miR-210可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA表達(dá)水平。

4miR-210可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、VEGFR2、Notch1蛋白的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色結(jié)果顯示，VEGF、VEGFR2陽(yáng)性紅色熒光信號(hào)位于細(xì)胞胞漿和胞膜，與對(duì)照組比較，miR-210過(guò)表達(dá)組VEGF和VEGFR2紅色熒光信號(hào)均顯著增強(qiáng)，通過(guò)Image J軟件半定量分析，VEGF和VEGFR2熒光吸光度值明顯增加(Plt;0.05)，見(jiàn)圖4。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-210過(guò)表達(dá)組血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch1的蛋白表達(dá)條帶信號(hào)增強(qiáng)，通過(guò)Image J軟件半定量分析，miR-210過(guò)表達(dá)組蛋白表達(dá)量為4.22±0.60，對(duì)照組蛋白表達(dá)量為1，兩組比較有顯著差異(Plt;0.05),見(jiàn)圖5。

Figure 3.The expression of VEGF,VEGFR2 and Notch1 mRNA after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.RT-PCR showed that mRNA expression of VEGF,VEGFR2 and Notch1 was all up-regulated compared to LV-GFP group .±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV-GFP group.

Figure 4.The protein expression of VEGF and VEGFR2 after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.The result of immunofluorescence showed the protein expression of VEGF and VEGFR2 was up-regulated compared to LV+GFP group.A:VEGF (LV-GFP group);B: VEGF(LV- miR-210 -GFP group);C: VEGFR2(LV-GFP group);D: VEGFR2 (LV- miR-210 -GFP group).Bar=50um.E：VEGF and VEGFR2 protein fold change±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV+GFP group.

Figure 5.The expression of Notch1 after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.Western blotting showed that Notch1 was up-regulated compared to LV+GFP group±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV+GFP group.

討 論

近年研究表明，miRNA對(duì)血管新生具有重要的調(diào)控作用[8]。眾所周知，臟器缺血可誘發(fā)反應(yīng)性血管新生(angiogenesis)，即在原有血管的基礎(chǔ)上，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和重塑形成新血管[9]。通過(guò)促血管新生來(lái)修復(fù)缺血性損傷已成為國(guó)內(nèi)外新的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-210是缺氧誘導(dǎo)miRNA。缺氧時(shí)，miR-210在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成及細(xì)胞遷移，而抑制miR-210能阻斷血管新生[5]。我們的前期研究表明，腦缺血后皮質(zhì)區(qū)miR-210表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)[10]；小鼠腎缺血后miR-210亦表達(dá)上調(diào)，其靶基因ephrin-A3蛋白顯著下調(diào)[11]，但miR-210對(duì)缺血/缺氧后血管新生可能的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。故本研究通過(guò)在血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-210，探討其對(duì)血管新生相關(guān)信號(hào)分子的影響。

在血管生成過(guò)程中，VEGF是最重要的調(diào)控因子。研究表明，VEGF作為Notch信號(hào)的上游調(diào)控因子，可誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上Notch1和DLL4(Notch配體)的表達(dá)，從而促進(jìn)血管的發(fā)育[4]。miR-210能否對(duì)VEGF-Notch信號(hào)通路起調(diào)控作用，對(duì)于闡明缺血后血管新生的機(jī)制具有重要意義。

通過(guò)生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)，miR-210可調(diào)控VEGF[6]。有研究證實(shí)miR-210可影響內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF的敏感性[5]。但miR-210對(duì)Notch信號(hào)分子的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究過(guò)表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞的miR-210，觀(guān)察VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的變化。研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-210過(guò)表達(dá)組miR-210顯著上調(diào)，其靶基因ephrin-A3的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，證實(shí)LV- miR-210-GFP重組慢病毒載體可介導(dǎo)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-210； VEGF、VEGFR2、Notch1基因及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上調(diào)，說(shuō)明miR-210過(guò)表達(dá)可顯著上調(diào)VEGF-Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)水平。提示miR-210可通過(guò)VEGF-Notch信號(hào)通路參與血管新生的調(diào)控過(guò)程，為闡明miR-210調(diào)控血管新生的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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控制人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞多能性和決定早期細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)通路

胚胎源性人類(lèi)多能干細(xì)胞和重編程的(reprogrammed)體細(xì)胞來(lái)源的人類(lèi)多能干細(xì)胞的共同特征包括無(wú)限增殖和持久、廣泛地向各種類(lèi)型細(xì)胞分化的潛能。但是在維持細(xì)胞多能性和調(diào)控細(xì)胞分化方面，這兩種來(lái)源的細(xì)胞是否依賴(lài)相似的機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議，而在這些機(jī)制中出現(xiàn)任何一點(diǎn)差異都將會(huì)導(dǎo)致經(jīng)重編程的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的多能誘導(dǎo)干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的多能性發(fā)生異常改變。在此情況下，目前用于促使人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)擴(kuò)增和分化的方法可能并不能直接適用于人類(lèi)iPSCs的擴(kuò)增和分化。歐洲科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)iPSCs依賴(lài)activin/nodal/TGFβ信號(hào)通路，控制同源蛋白轉(zhuǎn)錄因子Nanog表達(dá)，從而維持其多能性(人類(lèi)ESCs也同樣依賴(lài)該信號(hào)通路)。由此可見(jiàn)，人類(lèi)iPSCs維持自身多能性的機(jī)制與人類(lèi)ESCs的機(jī)制相似。同時(shí)，他們還證實(shí)，在人類(lèi)ESCs特異地分化為胚外組織、神經(jīng)外胚層及中胚層的過(guò)程中，充足的生長(zhǎng)因子是其必要條件，而這些生長(zhǎng)因子同樣可以促使人類(lèi)iPSCs分化為以上各組織。以上實(shí)驗(yàn)為了避免可能出現(xiàn)的干擾發(fā)育機(jī)制分析的因素，是在純粹的化學(xué)合成的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，而且實(shí)驗(yàn)獲得的某些組織與今后臨床應(yīng)用需要的并不完全相同。綜上所述，人類(lèi)iPSCs維持自身多能性和調(diào)控自身分化所依賴(lài)的機(jī)制與人類(lèi)ESCs的機(jī)制相似，也可以說(shuō)這些不同類(lèi)型的多能細(xì)胞在功能方面是等同的。

Stem Cells,2009,27(11):2655-2666(李麗娜)

RegulatoryeffectofmiR-210overexpressiononVEGF-Notchsignalingpathway

LOU Yuan-lei1,LIU Fen1,GAO Fa-liang2,RUAN Qiong-fang1,CUI Su-ping1,DENG Zhi-feng2,WANG Yang1

(1InstituteofUrology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofNeurosurgery,TheSecondAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wangy63cn@sina.com)

AIM: To explore the potential mechanism of angiogenesis by investigating the regulatory effect of miR-210 overexpression on vascular endothelial growth factor(VEGF)-Notch signaling pathway.METHODSMiR-210 overexpression was induced in human umbilical vein endothelial(HUVE-12) cells by lentivirus transfection.The HUVE-12 cells were divided into 2 groups: miR-210 overexpression group (LV-miR-210-GFP) and control group (LV-GFP).The change of ephrin-A3 protein was detected by flow cytometry analysis.The mRNA and protein levels of VEGF-Notch signaling molecules,VEGF,VEGF receptor 2(VEGFR 2)and Notch 1,were determined by the methods of real-time PCR,immunofluorescence and Western blotting.RESULTSCompared to the control cells,significant down-regulation of ephrin-A3 protein was observed in HUVE-12 cells with miR-210 overexpression,while both mRNA and protein levels of VEGF,VEGFR2 and Notch1 were up-regulated.CONCLUSIONmiR-210 may be involved in VEGF-Notch signaling pathway to regulate angiogenesis.

miR-210; Vascular endothelial cells; Vascular endothelial growth factors; Notch1

1000-4718(2011)05-0923-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.017

2010-11-24

2011-03-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30960396；No.81060059)

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