陳 斌, 廖慧芳, 黎東明, 周 奇, 匡 銘, 沈順利, 彭寶崗△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1肝膽外科， 2檢驗(yàn)科， 廣東 廣州 510080)

AFP-L3陽性肝細(xì)胞癌患者腫瘤分期和外周血淋巴細(xì)胞亞群的研究*

陳 斌1, 廖慧芳2, 黎東明1, 周 奇1, 匡 銘1, 沈順利1, 彭寶崗1△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1肝膽外科，2檢驗(yàn)科， 廣東 廣州 510080)

目的： 分析小扁豆凝素結(jié)合型甲胎蛋白(AFP-L3)陽性的肝細(xì)胞癌患者腫瘤分期及外周血淋巴細(xì)胞的改變，探討AFP-L3水平與腫瘤分期及免疫狀態(tài)的關(guān)系。方法采集60例肝細(xì)胞癌患者外周血，檢測(cè)AFP及AFP-L3含量。根據(jù)外周血AFP-L3比例將60例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者分為2組：AFP-L3(+)組和AFP-L3(-)組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中各淋巴細(xì)胞亞群(NK、CD4+、CD8+、CD4/CD8、Treg)的比例。結(jié)果AFP-L3(+)組患者UICC分期Ⅲ+Ⅳ期為29例，AFP-L3(-)組為7例；AFP-L3(+)組患者BCLC分期C+D期為20例，AFP-L3(-)組為3例。AFP-L3(+)組患者發(fā)生血管侵犯為17例，遠(yuǎn)高于AFP-L3(-)組(1例)。AFP-L3(+)組患者外周血中NK細(xì)胞比例及CD4/CD8比值下降，CD8+T和Treg細(xì)胞顯著比例上升。結(jié)論外周血AFP-L3陽性的肝癌患者容易發(fā)生血管侵犯，且分期較差，可能與淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生變化、免疫系統(tǒng)受到抑制有關(guān)。

肝細(xì)胞癌； 小扁豆凝集素結(jié)合型甲胎蛋白； 腫瘤分期； 淋巴細(xì)胞亞群

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)病率在我國居惡性腫瘤發(fā)病率的第2位。外科手術(shù)切除、局部消融和肝移植是目前能夠使肝癌獲得根治的措施，但是多數(shù)患者診斷時(shí)已屆入中晚期，總體手術(shù)切除率不足30％[1]。因此早期診斷對(duì)于提高肝癌的總體療效具有重要意義。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是當(dāng)前普遍用于肝癌早期診斷的腫瘤標(biāo)記物。近年來，研究發(fā)現(xiàn)AFP存在多種異質(zhì)體，其中小扁豆凝集素結(jié)合型AFP(Lensculinarisagglutinin-reactive AFP,AFP-L3)被認(rèn)為是原發(fā)性肝癌的特異性標(biāo)記物，有助于肝癌的早期診斷。同時(shí)有研究提示AFP-L3和肝癌的惡性程度及預(yù)后有關(guān)，AFP-L3升高者腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲性，預(yù)后較差，但具體原因不明[2-8]。本研究擬分析AFP-L3陽性肝細(xì)胞癌患者的腫瘤分期和外周血中淋巴細(xì)胞亞群變化特點(diǎn)，研究外周血AFP-L3水平與腫瘤分期以及機(jī)體的免疫狀態(tài)間的關(guān)系，從免疫機(jī)制方面探討AFP-L3陽性肝癌患者腫瘤惡性程度更高的原因。

材 料 和 方 法

1臨床資料

選取2009年8月至2010年11月間于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科診治的肝細(xì)胞癌患者共60例。男48例，女12例，年齡18-75歲。排除合并妊娠、自身免疫性疾病、糖尿病、營養(yǎng)不良及使用免疫抑制劑患者。所有患者均經(jīng)病理確診。

2臨床分期

采用國際防癌聯(lián)盟(UICC，第7版)肝癌TNM分期及巴塞羅那臨床分期(BCLC)對(duì)所有入選的肝細(xì)胞癌病例進(jìn)行分期。

3病例分組

入選的肝細(xì)胞癌病例分為2組：(1) AFP-L3(+)組： AFP-L3≥10％；(2) AFP-L3(-)組：AFP-L3lt;10％。

4主要試劑

AFP-L3親和吸附離心管(產(chǎn)品編號(hào)YZB/國1343-2008)購自北京熱景生物技術(shù)有限公司。單克隆抗體FITC-CD3、APC-CD56、PE-CD16、PE-CD3、FITC -CD4、APC-CD8、FITC -CD4、APC-CD25、PE-Foxp3及Human FoxP3 Buffer Set和Stain Buffer (FBS)均購自BD。Ficoll-Paque PLUS(編號(hào)：17-1440-02)淋巴細(xì)胞分離液購自GE Healthcare。

5方法

5.1AFP及AFP-L3的測(cè)定 按AFP-L3親和吸附離心管操作說明書進(jìn)行：患者取空腹靜脈血，離心后取400 μL血清，以試劑盒所配的清洗液600 μL稀釋后，加入親和吸附離心管中，室溫靜置10 min,加入1.2 mL的清洗液清洗，3 000 r /min離心20 s。更換離心管外管，再加入600 μL試劑盒所配的洗脫液，3 000 r/min離心20 s，獲得含有AFP-L3的洗脫液。將未稀釋的血清及含有AFP-L3的洗脫液一起送檢驗(yàn)科，以化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)AFP及AFP-L3的含量。AFP-L3含量×2.5即為血清中AFP-L3含量。AFP-L3比例=血清AFP-L3/總AFP。

5.2流式細(xì)胞術(shù)分析 用PBS按1∶1比例稀釋靜脈血，加到淋巴細(xì)胞分離液上層，淋巴細(xì)胞分離液和稀釋靜脈血比例為3∶4(按淋巴細(xì)胞分離液說明書)，400×g離心30 min，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。PBS洗滌2次，計(jì)數(shù)，行臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞活性gt;95％。加入適當(dāng)劑量的抗體染色后，以FACS 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群：NK細(xì)胞(CD3+CD16+CD56+)、CD4+細(xì)胞(CD3+CD4+)、CD8+細(xì)胞(CD3+CD8+)和Treg細(xì)胞 (CD4+CD25+Foxp3+)。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1AFP-L3陽性組的患者較AFP-L3陰性的患者腫瘤更容易發(fā)生血管侵犯

AFP-L3(+)組(n=35)和AFP-L3(-)組(n=25)腫瘤發(fā)生血管侵犯、膽管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、鄰近器官侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、合并肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的例數(shù)和比例分別為17例(48.57％)vs1例(4.00％)、1例(2.86％)vs2例(8.00％)、0例(0％)vs2例(8.00％)、4例(11.43％)vs2例(8.00％)、2例(5.71％)vs0例(0.00％)、17例(48.57％)vs6例(24.00％)。各組間比較結(jié)果提示AFP-L3升高的患者更容易發(fā)生血管侵犯(Plt;0.01),見表1。而膽管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、鄰近器官侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特征組間均無明顯差異(Pgt;0.05)。雖然AFP-L3(+)組肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高于AFP-L3(-)組，但亦無明顯差異(Pgt;0.05)，見表1。

2AFP-L3陽性組患者腫瘤分期較差

按UICC發(fā)表的第7版肝癌TNM分期方法對(duì)所有病例進(jìn)行分期。AFP-L3(+)組35例患者中Ⅰ+Ⅱ期6例(17.14％)，Ⅲ+Ⅳ期29例(82.86％)。AFP-L3(-)組25例患者中Ⅰ+Ⅱ期18例(72.00％)，Ⅲ+Ⅳ期7例(28.00％)。AFP-L3(+)組Ⅲ+Ⅳ期比例高于AFP-L3(-)組(Plt;0.01)，見表2。

表1 AFP-L3陽性和陰性腫瘤臨床特征的比較

表2 AFP-L3陽性和陰性組腫瘤分期的比較(UICC)

按BCLC方法對(duì)所有病例進(jìn)行分期。AFP-L3(+)組35例患者中A+B期15例(42.86％)，C+D期20例(57.14％)。AFP-L3(-)組25例患者中A+B期22例(88.00％)，C+D期3例(12.00％)。AFP-L3(+)組C+D期比例高于AFP-L3(-)組(Plt;0.01)，見表3。

表3 AFP-L3陽性和陰性腫瘤按BCLC分期的比較

3AFP-L3陽性組患者外周血中NK細(xì)胞比例和CD4/CD8比值降低,CD8+細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例上升

AFP-L3(+)組患者外周血中NK細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞比例較AFP-L3(-)組顯著降低(Plt;0.05)，見表4、圖1，分別為(10.56±8.35)％vs(15.59±9.78)％。AFP-L3(+)組和AFP-L3(-)組患者外周血中CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的比例分別為(32.84±9.46)％vs(37.61±9.38)％、(25.48±10.24)％vs(18.55±8.35)％，CD4/CD8比值分別為1.63±1.19vs2.44±1.29。AFP-L3(+)組CD4+細(xì)胞比例減少，但與AFP-L3(-)組相比無顯著差異(Pgt;0.05)，CD8+細(xì)胞顯著比例升高(Plt;0.01)，CD4/CD8比值顯著升高(Plt;0.01)，見表4、圖2。此外，兩組外周血中Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例分別為(9.27±2.95)％和(7.20±1.09)％，AFP-L3(+)組Treg細(xì)胞比例明顯升高(Plt;0.01)，見表4、圖3。

表4 AFP-L3陽性和陰性患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的比較

Figure 3.Treg cells in peripheral blood of patients in AFP-L3(+) group and AFP-L3(-) group.±s.**Plt;0.01 vs AFP-L3(-).

討 論

AFP很早就作為肝癌的篩查和診斷的指標(biāo)。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)多種AFP異質(zhì)體，其中AFP-L3是原發(fā)性肝癌的特異性指標(biāo)，能夠早期診斷肝癌，甚至可以早于影像學(xué)檢查[2,3]，且和肝癌的惡性程度及預(yù)后有聯(lián)系。AFP-L3水平升高者多伴有腫瘤分化偏低、更容易發(fā)生門靜脈侵犯的特征，但與腫瘤的大小和AFP水平無關(guān)。AFP-L3陽性的腫瘤更具侵襲性，且AFP-L3水平與靜脈侵犯呈正相關(guān)[4-6]。此外，AFP-L3還是行TACE和消融治療的預(yù)后指標(biāo)，AFP-L3陽性患者TACE治療后2年生存率明顯低于AFP-L3陰性患者( 21.2％vs78.6％)[7]，而AFP-L3陽性患者消融治療后5年生存率由62.9％下降至50.0％[8]。我們通過對(duì)臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，AFP-L3陽性患者腫瘤無論按照UICC還是BCLC分期，分期均較AFP-L3陰性的患者更差，更容易產(chǎn)生血管侵犯和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，說明AFP-L3陽性的腫瘤更具侵襲性，與之前其它報(bào)道結(jié)果一致。

免疫耐受和免疫抑制是機(jī)體不能產(chǎn)生有效抗腫瘤免疫反應(yīng)、腫瘤無限制增殖并發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因，影響著腫瘤的發(fā)展和生物學(xué)特性，也影響著腫瘤的治療效果[9]。肝癌可以誘發(fā)機(jī)體免疫抑制狀態(tài)，如外周血中CD3+和CD4+細(xì)胞數(shù)目下降，CD4/CD8比值下降[10]；而外周血以及腫瘤組織的Treg增加也嚴(yán)重地影響了機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)[11]。腫瘤誘發(fā)的機(jī)體免疫耐受狀態(tài)和微環(huán)境紊亂使得機(jī)體產(chǎn)生的抗腫瘤免疫效應(yīng)不能有效地控制肝癌的進(jìn)展。

本研究提示AFP-L3陽性肝細(xì)胞癌患者的外周血淋巴細(xì)胞亞群紊亂和肝癌侵襲性有一定關(guān)系。AFP-L3陽性肝細(xì)胞癌患者外周血NK細(xì)胞比例下降，CD8+淋巴細(xì)胞比例上升，CD4/CD8比值下降，Treg比例上升。NK細(xì)胞是和T細(xì)胞、B細(xì)胞不同的免疫細(xì)胞，為非特異性殺傷細(xì)胞，在腫瘤免疫中起重要作用。進(jìn)展期肝癌的可溶性MHCⅠ抗原可以影響NK細(xì)胞的功能[12]，致使外周血和局部的NK細(xì)胞比例和功能都有所下降[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示激活NK細(xì)胞可以延緩腫瘤的發(fā)展[14]。我們發(fā)現(xiàn)AFP-L3陽性的患者外周血中NK細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞比例明顯降低，腫瘤惡性程度更高。CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞在細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15,16]。而調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)是一種有負(fù)性調(diào)節(jié)作用的CD4+淋巴細(xì)胞亞群，可以抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫，清除或抑制Treg后具有抑制腫瘤生長的作用[17]。本研究中AFP-L3陽性患者外周血中NK細(xì)胞比例以及CD4/CD8比值下降提示各淋巴細(xì)胞亞群的比例失衡，患者抗腫瘤免疫反應(yīng)受到抑制。腫瘤有可能通過上調(diào)Treg細(xì)胞、下調(diào)NK細(xì)胞抑制了機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。雖然CD8+T細(xì)胞比例有所上升，但Treg細(xì)胞的上調(diào)有可能對(duì)其殺傷能力產(chǎn)生了抑制，從而使其抗腫瘤作用減弱。

[1]Bruix J,Sherman M.Management of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2005,42(5): 1208-1236.

[2]Taketa K,Endo Y,Sekiya C,et al.A collaborative study for the evaluation of lectin-reactive α-fetoproteins in early detection of hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,1993,53(22):5419-5423.

[3]Oka H,Saito A,Ito K,et al.Multicenter prospective analysis of newly diagnosed hepatocellular carcinoma with respect to the percentage of AFP-L3[J].J Gastroenterol Hepatol,2001,16(12):1378-1383.

[4]Okuda H,Nakanishi T,Takatsu K,et al.Clinicopathologic features of patients with hepatocellular carcinoma seropositive for α-fetoprotein-L3 and seronegative for des- γ-carboxy prothrombin in comparison with those seropositive for des-γ-carboxy prothrombin alone[J].J Gastroenterol Hepatol,2002,17(7):772-778.

[5]Hagiwara S,Kudo M,Kawasaki T,et al.Prognostic factors for portal venous invasion in patients with hepatocellular carcinoma[J].J Gastroenterol,2006,41(12):1214-1219.

[6]Carr BI,Kanke F,Wise M,et al.Clinical evaluation of lens culinaris agglutinin-reactive alpha-fetoprotein and des-gamma-carboxy prothrombin in histologically proven hepatocellular carcinoma in the United States[J].Dig Dis Sci,2007,52(3):776-782.

[7]Song BC,Suh DJ,Yang SH,et al.Lens culinaris agglutinin-reactive alpha-fetoprotein as a prognostic marker in patients with hepatocellular carcinoma undergoing transcatheter arterial chemoembolization[J].J Clin Gastroenterol,2002,35(5):398-402.

[8]Toyoda H,Kumada T,Kaneoka YJ,et al.Prognostic value of pretreatment levels of tumor markers for hepatocellular carcinoma on survival after curative treatment of patients with HCC[J].J Hepatol,2008,49(2):223-232.

[9]汪禮坤， 匡 銘， 彭寶崗， 等.Tregs調(diào)節(jié)小鼠肝癌局部引流淋巴結(jié)內(nèi)免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能[J].中國病理生理雜志，2010,26(5):922-927.

[10]Attallah AM,Tabll AA,El-Sadany M,et al.Dysregulation of blood lymphocyte subsets and natural killer cells in schistosomal liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma[J].Clin Exp Med,2003,3(3):181-185.

[11]Ormandy LA,Hillemann T,Wedemeyer H,et al.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,2005,65(6):2457-2464.

[12]Jinushi M,Takehara T,Tatsumi T,et al.Impairment of natural killer cell and dendritic cell functions by the soluble form of MHC class I-related chain A in advanced human hepatocellular carcinomas[J].J Hepatol,2005,43(6):1013-1020.

[13]Cai L,Zhang Z,Zhou L,et al.Functional impairment in circulating and intrahepatic NK cells and relative mechanism in hepatocellular carcinoma patients[J].Clin Immunol,2008,129(3):428-437.

[14]Elinav E,Abd-Elnabi A,Pappo O,et al.Suppression of hepatocellular carcinoma growth in mice via leptin,is associated with inhibition of tumor cell growth and natural killer cell activation[J].J Hepatol,2006,44(3):529-536.

[15]Mumber GD,Monach PA,Wanderling S,et al.CD4+T cells eliminate MHC class II-negative cancer cellsinvivoby indirect effects of IFN-γ[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(15): 8633-8638.

[16]Bricard G,Bouzourene H,Martinet O,et al.Naturally acquired MAGE-A10- and SSX-2-specific CD8+T cell responses in patients with hepatocellular carcinoma[J].J Immunol,2005,174(3): 1709-1716.

[17]Shen XH,Li N,Li H,et al.Increased prevalence of regulatory T cells in the tumor microenvironment and its correlation with TNM stage of hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2010,136(11):1745-1754.

TumorstagesandperipheralbloodlymphocytesubsetsinpatientswithAFP-L3-positivehepatocellularcarcinoma

CHEN Bin1,LIAO Hui-fang2,LI Dong-ming1,ZHOU Qi1,KUANG Ming1,SHEN Shun-li1,PENG Bao-gang1

(1DepartmentofHepatobiliarySurgery,2ClinicalLaboratory,TheFirstAffiliateHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:pengbaogang@medmail.com.cn)

AIM: To analyze the variations of tumor stages and peripheral blood lymphocyte subsets inLensculinarisagglutinin-reactive alpha-fetoprotein (AFP-L3) -positive hepatocellular carcinoma (HCC) and to explore the relationship between tumor stage,immune state and AFP-L3.METHODSPeripheral blood of sixty HCC patients was collected.The concentrations of AFP and AFP-L3 were detected.The patients were divided into 2 groups according to the expression of AFP-L3: AFP-L3 (+) group and AFP-L3 (-) group.The variations of T-lymphocyte subsets,natural killer T-cells (NK,CD3+CD16+CD56+),CD4+T-cells (CD3+CD4+),CD8+T-cells (CD3+CD8+),CD4/CD8 ratio and regulatory T-cells (Treg,CD4+CD25+Foxp3+),were analyzed by flow cytometry.RESULTSAccording to the International Union against Cancer (UICC) staging system,29 patients in AFP-L3 (+) group were in stage III and IV,while only 7 patients in AFP-L3 (-) group were in stage III and IV.According to the Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) staging system,20 patients in AFP-L3 (+) group were in stage C and D,while only 3 patients in AFP-L3(-) group were in stage C and D.Seventeen patients in AFP-L3 (+) group suffered vascular invasion,significantly more than those in AFP-L3 (-) group.The percentage of NK cells and CD4/CD8 ratio decreased in AFP-L3 (+) group,while the percentages of CD8+and Treg cells significantly increased.CONCLUSIONThe AFP-L3 (+) patients have liability to vascular invasion and worse tumor stages,which may relate to variations of lymphocyte subsets and suppression of the immune system.

Hepatocellular carcinoma;Lensculinarisagglutinin-reactive alpha-fetoprotein; Tumor staging; Lymphocyte subsets

1000-4718(2011)05-0843-05

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.003

2011-03-09

2011-04-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81071892)；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2008B080703031；No.2010B031500026)

△通訊作者 Tel:020-87755766-8214；E-mail：pengbaogang@medmail.com.cn