張 杰 鄭慧麗 閆 威 (中國醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室,遼寧 沈陽 000)

泛素(ubiquitin)是一類在真核細胞中廣泛存在的保守的小的調(diào)節(jié)蛋白,在多種蛋白的泛素蛋白酶體級聯(lián)反應降解中發(fā)揮作用,泛素參與了對細胞周期蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤抑制因子、癌蛋白及膜蛋白等多種蛋白的降解。而類泛素蛋白 (ubiquilin,UBQLN)是一類稱之為 PL I Cs(mouse p rotein linking integrin-associated p rotein with cytoskeleton)的蛋白家族〔1〕。UBQLN含有N末端的類泛素化特征結構域 UBL(ubiquitin-like)和 C末端的泛素結合域 UBA(ubiquitin-associated),其中 UBA結構域存在于泛素化特征反應機制的多種酶體系中,與蛋白酶體和泛素連接酶(E3)相結合,因此 UBA結構域被認為是在泛素化機制中與蛋白酶體連接,在蛋白酶體的降解過程中發(fā)揮作用的特征結構〔2〕。ubiquilin3基因是 2000年 Conklin等發(fā)現(xiàn)的人睪丸組織特異基因,位于 11p15位點,編碼一種類泛素蛋白 UBQLN3,小鼠睪丸組織有其同源 ubiquilin3基因〔3〕。有關 ubiquilin3基因功能意義的研究目前尚未見報道。本研究通過觀察 ubiquilin3 mRNA和蛋白水平的表達,從而確認 ubiquilin3基因是小鼠睪丸組織特異性表達基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性 C57BJ/6小鼠,由美國內(nèi)華達大學醫(yī)學院動物中心提供。

1.1.2 試劑與藥品 Ambion總 RNA提取試劑盒;Hybond-XL,Amersham Biosciences轉(zhuǎn)印膜;Redior imeⅡ標記試劑盒(Amersham);cDNA合成試劑盒購自 Promega公司;PCR試劑盒購自 Q IAN GEN公司;兔 UBQLN3多克隆抗體購自 Santa Cruz Bio techno logy公司;Quick PrepTMMicro mRNA Purification試劑盒購自 GE health care公司;ECL試劑盒購自碧云天生物技術公司;HRP耦聯(lián)及 FITC標記羊抗兔 IgG購自北京中山金橋公司。常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)及組織分離 C57BL/6雄性小鼠在美國內(nèi)華達大學醫(yī)學院動物中心要求的合適的飼養(yǎng)溫度和濕度條件下飼養(yǎng),并保證食物和水的供給。分別收集初生、7、14、21、28、35、42 d和成熟的小鼠睪丸組織。分離的睪丸組織立即放人液氮中,用于提取 RNA、RT-PCR、包埋切片、Western印跡、免疫熒光等實驗。研究中所用動物的實驗方法和過程按照內(nèi)華達大學動物飼養(yǎng)與使用協(xié)會的指導進行。

1.2.2 PCR 小鼠多種組織、發(fā)育不同階段的小鼠睪丸組織進行 RT-PCR實驗。小鼠 ubiquilin3 RT-PCR特異引物:正義鏈 :5′-TCCTGCTTGCCTGAGTCAC-3′;反 義 鏈 :5′-GCCAATTCCTCCTTTTCCTT-3′。反應體系 25μl,循環(huán)條件為:95℃15 m in,94℃15 s,53℃30 s,72℃35 s,30個循環(huán)。每組實驗重復3次。

1.2.3 Northern印跡 用 Ambion總 RNA提取試劑盒分別從小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸、大腸、睪丸、卵巢、子宮組織及發(fā)育不同周齡的小鼠睪丸組織中提取總 RNA。RNA樣品(15mg)經(jīng) 1.2%的瓊脂糖 /甲醛凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)膜 (Hybond-XL,Amersham Biosciences)并經(jīng) XL-1500(Spectronics corporation)Spectrolinker紫外線 cross-linked。用正義鏈:5′-TGTGACTGGCTCTGGTTCAG-3′; 反 義 鏈:5′-TGCATATTGCCATTCACCAG-3′引物,以基因組 DNA為模板 PCR擴增得到 352 bp長度的 ubiquilin3探針。用 RediorimeⅡ標記試劑盒 (Amersham)將 Ubiquilin3探針用放射性同位素α-32P標記。在 65℃雜交緩沖液 (15% SDS,0.5 mol/L EDTA,100×Denhardt,1 mol/L NaH2PO4)中進行 Northern blot雜交,過夜,用洗滌緩沖液 (15%SDS,0.5 mol/L EDTA,1 mo l/L NaH2PO4,500μl Sa lmon sperm DNA)中 65℃洗 30 m in。雜交膜放到暗合中膠片曝光2～3 d,檢測雜交信號。

1.2.4 Western印跡 用于Western印跡分析的總蛋白,分別取自 9只小鼠的多種組織及初生、7、14、21、28、35、42 d的小鼠睪丸組織,蛋白濃度由 BCA分析方法確定。每泳道 100μg的蛋白提取物進行 10%Tri-鹽酸聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)印至Bio-Rad硝酸纖維素膜上,用 5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h。以1μg/m l濃度鼠抗兔 UBQLN3抗體與轉(zhuǎn)印膜 4℃結合過夜,TBST洗滌 3次后,分別與 1∶1 000濃度相應的 HRP耦聯(lián)二抗室溫孵育 1 h,TBST洗膜 3次,用 ECL化學發(fā)光法顯影。UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描成像,圖像分析軟件分析灰度值。每組實驗重復 3次。

2 結 果

2.1 PCR 應用 PCR方法觀察 ubiquilin3基因在 12種小鼠組織及不同發(fā)育周齡小鼠睪丸組織的表達,可見該基因在小鼠的睪丸組織中有明顯的高表達,在心臟、肺、腎和子宮中略有表達,確認 ubiquilin3基因在小鼠睪丸組織的表達要高于其他組織。見圖 1。

圖 1 PCR檢測 ub iqu ilin3 m RNA的表達

2.2 No rthern印跡 應用 Northern印跡方法觀察 ubiquilin3基因在 12種小鼠組織和不同發(fā)育周齡小鼠睪丸組織中的表達,可見 ubiquilin3基因只在小鼠睪丸組織中高表達,而在其他組織中沒有表達。而且該基因在 2周齡小鼠的睪丸組織中開始表達,3周齡表達量逐漸增加,至 4周齡小鼠中表達量達最高,且在成熟小鼠中持續(xù)表達。確認 ubiquilin3基因在小鼠睪丸組織特異性表達 (圖 2)。

圖 2 Northern blot分析 ub iqu ilin3 m RNA在睪丸組織中的特異表達

2.3 Western印跡 利用 UBQLN3特異抗體,應用 Western印跡方法觀察 UBQLN3蛋白在 9種小鼠組織及不同發(fā)育周齡小鼠睪丸組織中的表達,確認UBQLN3在小鼠睪丸組織中特異性表達,在 2周齡的小鼠睪丸組織中開始表達,且在成熟小鼠中持續(xù)表達,表達量達最高 (圖 3)。

圖 3 W estern印跡分析 UBQLN3的蛋白表達

3 討 論

醫(yī)學分子遺傳學與基因組學在生殖醫(yī)學上的研究進展表明:約有 10%～15%的男性不育與睪丸特異性基因相關。睪丸特異性基因表達調(diào)控的異常嚴重影響雄性生殖細胞的生長發(fā)育,導致少精、弱精、或精子畸形等現(xiàn)象的發(fā)生〔4～7〕。因此揭示各種原因不明的少精、弱精,特別是精子形態(tài)異常的原因及發(fā)病機制,對于防治男性不育癥具有特別重要的臨床意義。迄今為止,已被確認為精子發(fā)生過程所必需的基因多達 100多個〔8〕,其中許多是在睪丸組織特異性地表達的基因。

Spem1基因是美國內(nèi)華達大學醫(yī)學院生殖中心 Yan Wei教授研究室〔4～7,9～11〕敲除的一個睪丸組織特異表達基因〔4〕。該基因在哺乳動物種屬中高度保守,實驗證明 Spem1基因主要在精子形成的 6～15時期表達。這一階段是精子頂體、鞭毛和頭部形成的關鍵時期,因此 Spem1基因是在精子形成的最后階段,即控制精子形成的最后一步-精子質(zhì)膜的去除過程中發(fā)揮重要作用。Spem1基因缺失會導致精子頭部質(zhì)膜不能完全去除,殘留的質(zhì)膜阻滯精子頭部和頸部的伸展,從而導致精子頭部后折畸形,即 Spem1-/-小鼠精子頭部表型為彎鉤狀,此種彎鉤狀表型特征的精子頭部形態(tài)異常,前向運動受限,不具備正常受精能力,導致不育〔4〕。精子形成后期的質(zhì)膜中可檢測出多種蛋白的表達,如 Ubiquitin〔12〕、15-lipoxygenase(15-LOX)〔13〕和 Spem1。免疫熒光檢測 Spem1-WT和 Spem1-/-小鼠精子頭部和頸部的殘留質(zhì)膜蛋白發(fā)現(xiàn):Spem1-/-小鼠的殘留質(zhì)膜中同樣含有正常質(zhì)膜中存在的蛋白 Ubiquitin和 15-lipoxygenase,而且這兩種蛋白主要存在于 Spem1-/-小鼠精子頭部和頸部卷曲在一起沒有完全伸展的部位〔4〕。這些結果提示:Spem1基因敲除導致小鼠精子頭部彎鉤狀畸形的機制可能與參與精子質(zhì)膜形成的蛋白以及蛋白-蛋白間的相互作用相關。因此在前期實驗的基礎上,為探討 Spem1基因敲除導致小鼠不育的機制,我們利用酵母雙雜交體系篩選出與 Spem1相互作用的幾個候選蛋白,其中 UBQLN3是與 Spem1相互作用蛋白之一。

研究發(fā)現(xiàn):ubiquilin3與酵母的 DSK2、大鼠的 DA41和爪蟾的 XDRP1基因有高度的同源性,表明 ubiquilin3進化的保守性〔14,15〕。Funakoshi等人證明爪蟾的 XDRP1基因可通過與細胞周期素蛋白 cyclinA1和 cyclinA2相互作用來調(diào)節(jié)細胞周期進程,其分子基礎是 XDRP1以其 N末端的 UBL結構域與cyclin A1結合來抑制其降解,從而阻斷細胞周期進程〔14,15〕。Ravnik等人發(fā)現(xiàn) cyclinA1在男性生殖系統(tǒng)的表達具有明顯的組織表達特異性和時序表達的特異性,即它只在睪丸中表達,而且只在精母細胞減數(shù)分裂的 Ⅸ～Ⅻ階段表達〔16〕。因此XDRP1被認為是 cyclin A1依賴的 CDK激酶磷酸化的候選底物,而且磷酸化激活的 XDRP1只出現(xiàn)在M期〔14,15〕。

為揭示敲除 ubiquilin3基因的表型特征,本研究證明ubiquilin3的 mRNA和蛋白均在小鼠睪丸組織中特異表達,且在發(fā)育階段 2周齡小鼠開始表達,在 6dpp p r im itive type A sper matogonia等 10種生精細胞和 sertolil細胞中均可見到此種表達。前期的原位雜交實驗顯示 ubiquilin3基因表達在精母細胞的粗線期和雙線期、后期和末期,及精子細胞形成的 1～14時期。本研究表明在發(fā)育階段的小鼠中,ubiquilin3出現(xiàn)在發(fā)育 10 d小鼠的精母細胞中,即在處于成熟分裂的粗線期、雙線期、后期和末期的精母細胞中表達,以及精子細胞的 1～14時期表達。提示:ubiquilin3是睪丸特異基因,其表達活性與精子發(fā)生和精子成熟密切相關,尤其在精子發(fā)生的成熟分裂階段和精子形成的 1～14時期發(fā)揮重要作用。

迄今為止對 ubiquilin3基因的研究還僅限于它的表達譜的研究,對其在精子發(fā)生過程中發(fā)揮怎樣的作用;ubiquilin3基因缺失會導致精子形態(tài)和功能的哪些改變;與哪些下游蛋白相互作用;及其在精子成熟各階段精細的調(diào)節(jié)機制知之甚少。因此,對 ubiquilin3基因的功能研究,進一步發(fā)掘和深入揭示ubiquilin3基因在精子發(fā)生中的作用機制及探討男性不育的發(fā)病機制有重要的科學意義。同時在以后的研究中會結合臨床男性原因不明不育患者精子的 ubiquilin3基因表達及基因異常特征分析,揭示 ubiquilin3在精子生成與成熟及男性不育中的功能和相關調(diào)節(jié)機制,為臨床男性不育的診治和生殖健康提供理論依據(jù)和科學指導。

1 Kleijnen MF,Sh ih AH,Zhou P,et a l.The hPL I C p roteins may p rovide a link between the ubiquitination machinery and the p roteasome〔J〕.Mol Cell,2000;6(2):409-19.

2 Kleijnen MF,Alarcón RM,Howley PM.The Ub iquitin-associated domain of hPL IC-2 interacts with the p roteasome〔J〕.Mol Biol Cell,2003;14(9):3868-75.

3 Conklin D,Holder man S,Whitmore C,et a l.Molecular cloning,chromosome mapp ing and characterization ofUBQLN3 a testis-specific gene that contains an ubiquitin-like domain〔J〕.Gene,2000;249:91-8.

4 Zheng H,Stratton CJ,Morozum i K,et a l.Lack of Spem1 causes aberrant cytop lasm removal,sperm defor mation and male infertility〔J〕.Proc Natl Acad SciUSA,2007;17;104(16):6852-7.

5 Jin J,Jin N,Zheng H,et a l.Catsper3 and catsper4 are essential for sperm hyperactivated motility and male fertility〔J〕.Biol Rep rod,2007;77(1):37-44.

6 Jin JL,O′Doherty AM,Wang S,et a l.Catsper3 and catsper4 encode two cation channel-like p roteins exclusively exp ressed in the testis〔J〕.Biol Rep rod,2005;73:1235-42.

7 Yan W,Ma L,Burns KH,et a l.Hap loinsufficiency of kelch-like p rotein homolog 10 causes infertility in male m ice〔J〕.Proc NatlAcad SciUSA,2004;101:7793-8.

8 Rajkovic A,Yan C,Yan W,et a l.Obox,a fam ily of homeobox genesp referentially exp ressed in germ cells〔J〕.Genom ics,2002;79:711-7.

9 Wang S,Zheng H,Esaki Y,et a l.Cullin3 is a KLHL10-interacting p rotein p referentially exp ressed during late spermiogenesis〔J〕.Biol Rep rod,2006;74:102-8.

10 Yan W,Ma L,Zilinski CA,et a l.Identification and characterization of evolutionarily conserved pufferfish zebrafish,and frog orthologs of GASZ〔J〕.Biol Rep rod,2004;70:1619-125.

11 Yan W,Ma L,Burns KH,et a l.H ILS1 is a spermatid-specific linker histone H1-like p rotein imp licated in chromatin remodeling during mammalian spermiogenesis〔J〕.Proc NatlAcad SciUSA,2003;100:10546-51.

12 Kuster CE,Hess RA,Althouse GC. Immunofluorescence reveals ubiquitination of retained distal cytop las m ic drop lets on ejaculated porcine spermatozoa〔J〕.J Androl,2004;25:340-7.

13 Fischer KA,Van Leyen K,Lovercamp K W,et a l.15-Lipoxygenase is a componentof themammalian sperm cytop lasmic drop let〔J〕.Rep roduction,2005;130:213-22.

14 FunakoshiM,Geley S,Hunt I,et a l.Identification ofXDRP1,a Xenopus p rotein related to yeast Dsk2p binds to the N-terminus of cyclin A and inhibits its degredation〔J〕.EMBO,1999;18:5009-18.

15 Kanae Tanaka,Minoru Funakoshi,Kazue Inoue,et a l.Identification of two isoformsofDsk2-related p rotein XDRP1 in Xenopus eggs〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2006;350:768-73.

16 Ravnik SE,Wolgemuth DJ.Regulation of meiosis during mammalian sper matogenesis:the A-type cyclins and their associated cyclin-dependent kinases are differentially exp ressed in the germ-cell lineage〔J〕.Dev Biol,1999;207:408-8.