范一靈，朱東升，胡瑜，史賢明

1 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院陸伯勛食品安全研究中心 中美食品安全聯(lián)合研究中心，上海 200240

2 上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203

3 聯(lián)合利華 (上海) 研發(fā)中心 聯(lián)合利華中國(guó)研究所，上海 200335

金黃色葡萄球菌特異性PCR檢測(cè)靶點(diǎn)的自動(dòng)化篩選

范一靈1,2，朱東升1,3，胡瑜1，史賢明1

1 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院陸伯勛食品安全研究中心 中美食品安全聯(lián)合研究中心，上海 200240

2 上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203

3 聯(lián)合利華 (上海) 研發(fā)中心 聯(lián)合利華中國(guó)研究所，上海 200335

旨在挖掘用于鑒定金黃色葡萄球菌的高特異性靶點(diǎn)及其PCR檢測(cè)引物。采用C++語(yǔ)言編程，以金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus MRSA 252基因組編碼序列為對(duì)象，對(duì)2 656個(gè)可編碼區(qū)進(jìn)行分析，獲得特異性靶點(diǎn)序列，并設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。對(duì)包括葡萄球菌屬11個(gè)種及其他細(xì)菌屬在內(nèi)的共計(jì)137株細(xì)菌驗(yàn)證引物特異性，篩選獲得9個(gè)DNA序列，并設(shè)計(jì)了4對(duì)引物。經(jīng)驗(yàn)證2對(duì)引物的特異性較好，其中引物SA3的基因組DNA檢測(cè)限為13.7 fg/μL，菌體檢測(cè)限為9.25×102CFU/mL。結(jié)果驗(yàn)證了特異性DNA靶點(diǎn)篩選平臺(tái)的實(shí)用性，該方法突破了傳統(tǒng)特異性靶點(diǎn)挖掘方法對(duì)檢測(cè)對(duì)象的限制，適用性廣，可移植性強(qiáng)。

金黃色葡萄球菌，基因組，生物信息比對(duì)分析，編碼序列，C++編程

Abstract:The aim of this study was to establish a fast and accurate method for developing specific DNA sequences and PCR primers for the detection of Staphylococcus aureus. An automatic C++ program for genomic comparison was used to identify specific DNA sequences from the genome of S. aureus MRSA 252. Four primer pairs were obtained from 9 specific target sequences by comparison of 2656 coding sequences with our local genome database, and 2 pairs of primers were confirmed to be specific to S. aureus by PCR evaluation against 137 bacterial strains, including 11 species of Staphylococcus. Furthermore, the DNA detection sensitivity of primer SA3 was 13.7 fg/μL and the cell sensitivity for this primer was 9.25×102CFU/mL. This method has overcome the limitations of specific target mining in conventional assays, and it could be easily and widely used forother foodborne pathogens.

Keywords:Staphylococcus aureus, genome, bioinformatic comparison analysis, coding sequence, C++ programming

金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus是一種重要的食源性和醫(yī)源性致病菌[1]，它可以分泌多種毒力因子，如腸毒素 (Staphylococcal enterotoxins，SEs)、毒素休克綜合征毒素-1 (Staphylococcal toxic shock syndrome-1，TSST-1)、表皮剝脫毒素 (Exfoliative toxins，ETs)、葡萄球菌溶素 (Staphylolysin) 和凝固酶 (Coagulase) 等，可以引起食物中毒、毒素休克綜合征、骨髓炎、壞死性肺炎和心內(nèi)膜炎等嚴(yán)重疾病[2-3]。在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法仍然采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法，需要 5~6 d才能得到檢驗(yàn)結(jié)果[4]?？焖佟⒂行У貦z測(cè)和鑒別金黃色葡萄球菌是急需解決的問(wèn)題之一。近些年，以特異性DNA片段為靶點(diǎn)的分子生物學(xué)檢測(cè)手段作為一種快速檢測(cè)方法已被廣泛采用[3,5-10]。

細(xì)菌特異性 DNA是指僅存在于某一目標(biāo)細(xì)菌基因組內(nèi)、而在其他非目標(biāo)細(xì)菌基因組內(nèi)缺失或者變異、可用于特異性檢測(cè)和鑒定該目標(biāo)細(xì)菌的DNA片段[3]。在細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測(cè)中，常用的特異性保守區(qū)域DNA片段多位于16S rRNA和23S rRNA區(qū)。另外，nuc1基因是檢測(cè)金黃色葡萄球菌的重要靶點(diǎn)，它可以編碼產(chǎn)生一種金黃色葡萄球菌特有的與凝固酶相關(guān)的耐熱核酸酶 (TNase)[6-8,11]。除了上述檢測(cè)靶點(diǎn)外，其他特異基因片段還有coa基因[12]和tRNA間隔序列等[3,5]。然而，上述目標(biāo)DNA的檢測(cè)位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷了十分漫長(zhǎng)的研究過(guò)程。

隨著致病微生物基因組數(shù)據(jù)的增加，生物信息學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，大規(guī)模的基因組比對(duì)分析和蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)為快速、高效地發(fā)掘特異性DNA靶點(diǎn)提供了可能[13-15]。通過(guò)自動(dòng)化程序?qū)蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)編碼序列 (Coding sequences，CDS) 的比對(duì)和篩選，可以大幅度提高特異性檢測(cè)位點(diǎn)的發(fā)掘效率。

本研究在組建本地細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，建立了基于 C++編程的金黃色葡萄球菌特異性DNA序列自動(dòng)化篩選方法。利用該方法對(duì)金黃色葡萄球菌MRSA 252的全基因組編碼序列進(jìn)行分析，以獲得特異性DNA片段。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌培養(yǎng)及基因組DNA提取

本實(shí)驗(yàn)所用菌株共 137株，其中金黃色葡萄球菌分離株來(lái)自臨床樣本 (表 1)。實(shí)驗(yàn)所用菌株均接種于Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基中，160 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h備用。

細(xì)菌基因組DNA提取和純化采用QIAGEN公司DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用 100 μL TE緩沖液洗脫細(xì)菌基因組DNA，存放于?20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組CDS自動(dòng)化比對(duì)

在GenBank細(xì)菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù) (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov) 中，選取具有代表性的139個(gè)細(xì)菌的基因組數(shù)據(jù)，利用Blast軟件 (版本號(hào)Blast-2.2.9-ia32)建立本地基因組數(shù)據(jù)庫(kù) (不包含 14個(gè)金黃色葡萄球菌基因組信息)。采用基于C++平臺(tái)的基因組CDS比對(duì)程序[16]，分析金黃色葡萄球菌MRSA252的全基因組CDS信息 (文件來(lái)源NCBI數(shù)據(jù)NC_002952.ffn)。篩選參數(shù)為E＞4.0，L＞400 bp，由程序自動(dòng)比對(duì)每個(gè)Blast生成文件中的E值。對(duì)程序篩選出的CDS序列通過(guò)網(wǎng)上 Blast比對(duì) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，驗(yàn)證自動(dòng)篩選的CDS特異性。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及PCR檢測(cè)

采用PRIMER PREMIER 5.0軟件，對(duì)篩選出的CDS區(qū) DNA序列設(shè)計(jì)引物 (表 1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株Table 1 Bacteria strains tested in this assay

表2 特異性CDS區(qū)段的PCR擴(kuò)增引物Table 2 PCR primers against specific CDS

PCR擴(kuò)增體系為：1.0 μL細(xì)菌基因組DNA；1 U rTaq DNA聚合酶 (天根生化科技有限公司，北京)；1×PCR 緩沖液 [200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)；200 mmol/L KCl；100 mmol/L (NH4)2SO4]；2.0 mmol/L MgCl2；4種 dNTPs各 0.25 mmol/L；上、下游引物各10 nmol/L；加蒸餾水至25 μL。

采用 Peltier Thermal Cycler PTC-200 PCR儀(Bio-Rad Laboratories，USA) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：105 ℃熱蓋；95 ℃變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。

將6 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用10 μg/mL的EB溶液染色15 min，置于紫外成像儀(MultiImage Light Cabinet, Alphalmager) 內(nèi)觀察。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)選用100 bp DNA ladder (天根生化科技有限公司，北京)。

1.4 引物特異性評(píng)價(jià)和檢測(cè)限評(píng)價(jià)

初步評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)選擇15株細(xì)菌，包括11株金黃色葡萄球菌和4株非金黃色葡萄球菌。在上述PCR檢測(cè)體系中，利用設(shè)計(jì)的 4對(duì)引物對(duì)細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)引物的特異性。將初步評(píng)價(jià)結(jié)果較好的特異性引物，應(yīng)用于全部其他細(xì)菌的檢測(cè)驗(yàn)證中。

選取特異性較高的引物進(jìn)行檢測(cè)限的評(píng)價(jià)，分別采用金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 CMCC 26003的基因組 DNA濃度 10倍稀釋組和細(xì)菌菌體濃度 10倍稀釋組，對(duì)引物的DNA檢測(cè)限和菌體檢測(cè)限兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)?；蚪M DNA的濃度梯度為：1.37×107、1.37×106、1.37×105、1.37×104、1.37×103、1.37×102、13.7、1.37 fg/μL。細(xì)菌菌體濃度梯度為：9.25×106、9.25×105、9.25×104、9.25×103、9.25×102、9.25、0.925、0 CFU/mL (空白對(duì)照)。

1.5 人工污染樣品的制備

取新鮮雞蛋蛋液200 g，混勻后分成蛋液含量為25.0 g的樣品8份。其中隨機(jī)抽取2份蛋液，按照國(guó)標(biāo) GB/T 4789.10-2008金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)中規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。其余6份蛋液分為3組，向3組蛋液中加入金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 CMCC 26003菌懸液，接種量分別為9.25×102CFU/25 g、9.25 CFU/25 g和0.925 CFU/25 g。將人工污染的蛋液樣品加入到225 mL生理鹽水中混勻，吸取5 mL上述液體加入50 mL 7.5% NaCl肉湯中培養(yǎng)8 h。取1 mL肉湯培養(yǎng)物，按1.3中所述步驟進(jìn)行PCR檢測(cè)。每組做 2個(gè)平行試驗(yàn)。人工污染的樣品的后續(xù)步驟仍按國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。

1.6 食品污染調(diào)查應(yīng)用

調(diào)查市售加工點(diǎn)心類產(chǎn)品，包括漢堡、壽司、三明治、中西式糕點(diǎn)、包子、月餅、批薩和肉卷等共計(jì)185件，按國(guó)標(biāo)規(guī)定的前處理方法進(jìn)行增菌培養(yǎng)，取增菌肉湯1 mL采用本研究所用引物和PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行檢查；并同時(shí)取增菌肉湯分別采用DuPont BAX Q7熒光定量PCR方法和國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行檢查，比較三者對(duì)金黃色葡萄球菌的檢出情況。

2 結(jié)果

2.1 特異性CDS的自動(dòng)化篩選

金黃色葡萄球菌MRSA 252全基因組包含已注釋的編碼序列共有2 656個(gè)，通過(guò)C++篩選程序，獲得9個(gè)E＞4.0且L＞400 bp的CDS，分別命名為編碼區(qū) SA1至 SA9 (表 3)。通過(guò)比對(duì)驗(yàn)證，選出 4個(gè)特異性較好的CDS區(qū)設(shè)計(jì)檢測(cè)引物。

2.2 引物的特異性評(píng)價(jià)

將SA1-SA4這4對(duì)引物分別對(duì)11株金黃色葡萄球菌和4株非金黃色葡萄球菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。引物SA2和SA3對(duì)所用金黃色葡萄球菌 DNA 具有特異性 (圖 1)。137株細(xì)菌基因組DNA的PCR試驗(yàn)結(jié)果表明：引物SA2和SA3可以特異性鑒別金黃色葡萄球菌基因組DNA，試驗(yàn)所用非金黃色葡萄球菌基因組DNA未見(jiàn)PCR擴(kuò)增條帶(包括葡萄球菌屬內(nèi)的其他13個(gè)種)。

表3 金黃色葡萄球菌特異性CDS的自動(dòng)化篩選Table 3 Screening of specific CDS from S. aureus

圖1 金黃色葡萄球菌4對(duì)PCR引物的特異性驗(yàn)證圖Fig. 1 PCR specificity evaluations on four primers for S. aureus. 1?15: results for primer SA1; 17?31: results for primer SA2;33?47: results for primer SA3; 49?63: results for primer SA4. The bacterial strains (From left to right) tested for each pair of primers were S. aureus ATCC 27940, S. aureus ATCC 13565, S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 6538, S. aureus CMCC 26001, S. aureus ATCC6538, S. aureus ATCC25923, S. aureus ATCC12228, S. aureus ATCC29213, S. aureus strain B255, V.Parahaemolyticus strian 39001, Salmonella strain T16, S. aureus strain G64, S. capitis ATCC 49325 and E. coli strain 133; 16, 32,48: standard DNA marker.

2.3 引物的檢測(cè)限評(píng)價(jià)

通過(guò)PCR退火溫度梯度試驗(yàn) (48 ℃~62 ℃) 和鎂離子濃度梯度試驗(yàn) (0.5~3.0 mmol/L)，對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化。在56 ℃溫度下退火，鎂離子濃度為2.0 mmol/L時(shí)，引物SA2和SA3的PCR產(chǎn)物具有明亮的單一擴(kuò)增條帶，PCR擴(kuò)增效率較高。

根據(jù)特異性評(píng)價(jià)結(jié)果，采用優(yōu)化的 PCR反應(yīng)條件評(píng)價(jià)引物的檢測(cè)限。引物SA2的基因組DNA檢測(cè)限為 137 fg/μL (圖 2，Lane 6)；引物 SA3的基因組 DNA檢測(cè)限為 13.7 fg/μL (圖 2，Lane 15)。另外，引物SA2和引物SA3的菌體檢測(cè)限都能達(dá)到9.25×102CFU/mL (圖 3，Lane 5 和 Lane 15)。

圖2 引物SA2和SA3的基因組DNA檢測(cè)限試驗(yàn)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification of sensitivity tests genomic DNA of primer SA2 and SA3. 1?8: primer SA2 were applied; 10?17: primer SA3 were applied; 9: standard DNA marker. The genomic DNA of S. aureus ATCC 6538 were 1.37×107fg/μL, 1.37×106fg/μL,1.37×105fg/μL, 1.37×104fg/μL, 1.37×103fg/μL, 1.37×102fg/μL, 13.7 fg/μL and 1.37 fg/μL, respectively.

圖3 引物SA2和SA3細(xì)菌菌體檢測(cè)限試驗(yàn)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 PCR amplification of cell sensitivity tests for primer SA2 and SA3. 1?9: primer SA2 were applied; 11?19: primer SA3 were applied. 1?9 and 11?19: the cell concentrations of S. aureus CMCC 26003 were 9.25×106CFU/mL, 9.25×105CFU/mL,9.25×104CFU/mL, 9.25×103CFU/mL, 9.25×102CFU/mL, 9.25 CFU/mL, 0.925 CFU/mL and negative control, respectively; 10:standard DNA marker (From bottom to top: 100 bp, 250 bp, 500 bp, 750 bp, 1 000 bp and 2 000 bp).

2.4 人工污染雞蛋樣品和食品污染調(diào)查應(yīng)用

采用PCR方法 (含有引物SA2或SA3) 和國(guó)標(biāo)方法均能檢出樣品中含接種量為9.25×102CFU/25 g和 9.25 CFU/25 g的金黃色葡萄球菌；然而，在含0.925 CFU/25 g金黃色葡萄球菌樣品檢測(cè)中，由于

接種量太低，國(guó)標(biāo)方法和PCR方法均得到陰性結(jié)果。在調(diào)查檢驗(yàn)市售 185件樣品中，通過(guò)本研究的檢測(cè)方法共檢出金黃色葡萄球菌陽(yáng)性3株，占全部樣品的1.62%，與BAX Q7檢測(cè)系統(tǒng)和國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法得到的結(jié)果相同。

3 討論

傳統(tǒng)微生物特異性 DNA序列的發(fā)掘是基于對(duì)已知細(xì)菌特異性蛋白質(zhì)的分析，然后對(duì)調(diào)控或編碼該特異蛋白質(zhì)的基因或DNA片段進(jìn)行研究[3]。其中，不少序列既有種內(nèi)特異性又存在多態(tài)性，如 coa基因和 16S rRNA序列在金黃色葡萄球菌種的最低相似度僅為79%，只有尋找這些區(qū)段內(nèi)相對(duì)保守的部分進(jìn)行引物設(shè)計(jì)來(lái)提高特異性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選出的4個(gè)金黃色葡萄球菌CDS區(qū)不存在種內(nèi)多態(tài)性，保守性好。SA2基因在金黃色葡萄球菌種內(nèi)相似性在 99%以上，SA1、SA3和 SA4基因在金黃色葡萄球菌種內(nèi)相似性不低于93%。

分析金黃色葡萄球菌CDS序列對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物信息可知，這些編碼序列均與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控的基因有關(guān) (表3)。其中，SA1和SA3的表達(dá)產(chǎn)物分別為透性酶SirC和SirB (Siderophore compound ABC transporter permease protein SirC and SirB)。通過(guò)對(duì)Sir系列蛋白質(zhì)序列的分析研究顯示，許多細(xì)菌都含有類似 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子功能的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[18-20]，如表面葡萄球菌和沙門(mén)氏菌等[20-22]。通過(guò)DNA序列分析，金黃色葡萄球菌的sirB和sirC基因都具有很好的保守性[23]，和本研究的結(jié)論相符。由于sirB和sirC基因可能是多拷貝基因[24]，更適合用于對(duì)靈敏度要求較高的致病菌檢測(cè)方法。SA2的表達(dá)產(chǎn)物為蔗糖專屬 PTS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因(Sucrose-specific PTS transporter protein RpiR family transcriptional regulator)。RpiR蛋白可能與編碼磷酸核糖異構(gòu)酶的rpiB基因調(diào)控有關(guān)[25]。SA4則被推定為細(xì)胞壁纖維連接蛋白基因，其表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)推定蛋白EbhB (Cell wall associated fibronectin-binding protein，hypothetical protein EbhB)。通過(guò)基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn) ebh基因廣泛存在于金黃色葡萄球菌基因組中[26]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

大量可供分析的微生物基因組序列信息已成為生物信息學(xué)研究的重要內(nèi)容[13-15]。本研究結(jié)合 C++程序調(diào)用Blast軟件，對(duì)金黃色葡萄球菌基因組進(jìn)行自動(dòng)比對(duì)，篩選編碼區(qū)特異性DNA序列。該方法簡(jiǎn)單實(shí)用，可以快速鎖定微生物特異性檢測(cè)位點(diǎn)，提高比對(duì)效率，為建立基于微生物特異性DNA序列的快速檢測(cè)方法提供了大量關(guān)鍵的備選目標(biāo)區(qū)間。

致謝：真誠(chéng)感謝美國(guó)農(nóng)業(yè)部東部研究中心George C.Paoli博士為本研究提供了大量標(biāo)準(zhǔn)菌株。

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Screening of specific target sequences for the PCR detection of Staphylococcus aureus by automatic genomic comparison

Yiling Fan1,2, Dongsheng Zhu1,3, Yu Hu1, and Xianming Shi1
1 Joint Sino-US Food Safety Research Center & Bor Luh Food Safety Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240, China
2 Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203, China
3 Unilever Discover Shanghai, Unilever Research and Development Shanghai, Shanghai 200335, China

Received: July 8, 2010; Accepted: January 20, 2011

Supported by: National Key Technology Research and Development Program of China (No. 2009BAK43B31), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (Nos. 10142201300, 08142200700, 08391911000).

Corresponding author: Xianming Shi. Tel/Fax: +86-21-34206616; E-mail: xmshi@sjtu.edu.cn

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