陳 莉， 王紅祥， 趙 湜， 李 娜， 張文靜， 丁 勝

(武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430014)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝綜合征。血管并發(fā)癥是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響了糖尿病患者的生活質(zhì)量，其發(fā)生與血管內(nèi)皮細(xì)胞及其前體細(xì)胞內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)相關(guān)。高游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)作為糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生中的重要環(huán)節(jié)，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用已經(jīng)有較多研究，但其對(duì)EPCs的影響及其機(jī)制均不清楚。為此，本研究將FFA作用于EPCs，觀察其增殖及凋亡的變化，并檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子叉頭框O1(forkhead box O1，F(xiàn)OXO1)蛋白的表達(dá)，以進(jìn)一步了解糖尿病血管并發(fā)癥中FFA所起的作用，為其防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

M199培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco。牛血清白蛋白(bouvine serum albumin，BSA)和疊氮化鈉購(gòu)自Sigma。25 cm2培養(yǎng)瓶及各種培養(yǎng)板、離心管均購(gòu)自Corning。MTT購(gòu)自華美生物工程公司。胰蛋白酶購(gòu)自上海生工生物工程公司。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海生化試劑二廠(比重1.077)。人纖維連接蛋白(human fibronectin，HFN)購(gòu)自Chemicon。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購(gòu)自Peprotech。FITC標(biāo)記抗CD34抗體和抗CD133抗體購(gòu)自BD。Trizol購(gòu)自Invitrogen，cDNA第1鏈合成試劑盒、Taq DNA聚合酶和dNTP購(gòu)自Fermentas。引物由北京奧科公司合成。

2 對(duì)象與分組

32例2型糖尿病患者(DM組)均符合1999年WHO糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)，男21例，女11例，平均年齡(45.1±11.7)歲，體重指數(shù)(26.3±12.5)kg/m2，糖尿病病程平均(14.8±8.4)年，糖化血紅蛋白(8.2% ±2.5%)，其中吸煙13例。對(duì)照組20例為來(lái)院體檢的健康人，男14例，女6例，平均年齡(44.4±10.2)歲，體重指數(shù)(24.2±8.7)kg/m2。2組年齡和體重指數(shù)經(jīng) t檢驗(yàn)，差異無(wú)顯著(P＞0.05)。2組均排除了各種感染、潰瘍或近期手術(shù)等可能影響EPCs和導(dǎo)致周圍血管并發(fā)癥的情況［1］。

3 FFA的配制

取棕櫚酸，用乙醇配制成100 mmol/L的濃度;取牛血清白蛋白，用蒸餾水配制成10%BSA溶液;取50 μL 100 mmol/L棕櫚酸溶液，加入上述10%BSA溶液中，在55℃水浴中靜置15 min，直至溶液澄清，－20℃保存。臨用前在55℃水浴放置至澄清。

4 EPCs的培養(yǎng)

EPCs的培養(yǎng)及鑒定參照文獻(xiàn)［2］。簡(jiǎn)述如下。取空腹外周靜脈血15 mL，常規(guī)密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，并懸浮于5 mL M199培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、VEGF 10 μg/L、bFGF 2 μg/L、EGF 5 μg/L、青霉素1×105μ/L、鏈霉素100 mg/L)中，將其鋪在纖維連接蛋白包被20 min的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃、飽和濕度、5%CO2溫箱中培養(yǎng)4 d。然后以M199培養(yǎng)基輕輕洗去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)以上述完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7 d。將DiI－acLDL(2.4 mg/L)加入EPCs培養(yǎng)體系中，37℃孵育1 h。PBS洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的UEA－I(10 mg/L)，37℃繼續(xù)孵育1 h。4%多聚甲醛固定10 min后于熒光顯微鏡下觀察。FITC－UEA－I和DiI－acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs。

5 EPCs增殖能力檢測(cè)

分別收集對(duì)照組和糖尿病組的EPCs，調(diào)整細(xì)胞濃度后將等量EPCs接種到包被有HFN的96孔培養(yǎng)板中，加入 FFA，使其濃度分別為 0、10和50 mmol/L。以絲裂霉素C處理30min的相同來(lái)源的EPCs作為對(duì)照，培養(yǎng)20 h，然后每孔加 10 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h后吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min，選擇490 nm 波長(zhǎng)，在自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度(absorbance，A)值，并計(jì)算增殖率。增殖率(%)=(A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照－1)×100%

6 EPCs凋亡的檢測(cè)

分別收集對(duì)照組和糖尿病組EPCs，與不同濃度FFA共培養(yǎng)48 h后，用PBS充分洗滌，胰酶消化后分別加入FITC標(biāo)記的Annexin－V和PI溶液(操作按說(shuō)明書進(jìn)行)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cell Quest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Annexin－V陽(yáng)性同時(shí)PI陰性的細(xì)胞計(jì)為早期凋亡細(xì)胞，將AnnexinV和PI均為陽(yáng)性的細(xì)胞計(jì)為晚期凋亡細(xì)胞。計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

7 RT－PCR法檢測(cè)FOXO1 mRNA表達(dá)

Trizol一步法提取EPC總RNA，操作按說(shuō)明書進(jìn)行。紫外分光光度儀測(cè)定RNA的A260/A280值。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，其中5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，核糖核酸酶抑制劑 1 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，寡聚 T引物1 μL，細(xì)胞總 RNA 2 μL，M － MLV(逆轉(zhuǎn)錄酶)1 μL，用焦碳酸二乙酯(DEPC)三蒸水補(bǔ)充至 20 μL。反應(yīng)條件為42℃ 1 h，然后70℃10 min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。引物參照GenBank庫(kù)中的cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。FOXO1:上游引物5＇－ GCAACGCGTGGGGCAACCTGT－3＇，下游引物 5＇－ GGGCACGCTCTTCACCATCCACTC－3＇，擴(kuò)增片段 116 bp。β － actin:上游引物 5＇－ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA －3＇，下游引物5＇－ CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC －3＇，擴(kuò)增片段 540 bp。反應(yīng)體系25 μL，其中 10 × PCR 緩沖液 2.5 μL，cDNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL(1 U)，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.2 μmol/L FOXO1 及 β －actin 上游及下游引物各1 μL，25 μmol/L MgCl2溶液2 μL。擴(kuò)增條件:首次94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃1 min，循環(huán)33次，最后72℃ 10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，用 2%的瓊脂糖凝膠(溴化乙啶濃度為0.5 mg/L)電泳，100 bp DNA為分子量標(biāo)準(zhǔn)，在300 nm紫外光下攝影。

8 Western blotting法檢測(cè)FOXO1蛋白表達(dá)

應(yīng)用TriPure提取蛋白法提取DM組和對(duì)照組EPCs蛋白，定量為2 g/L，每泳道點(diǎn)樣20 μg提取蛋白，經(jīng)10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h，轉(zhuǎn)膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉后，分別加入小鼠抗人FOXO1單克隆抗體(1∶100)和小鼠抗人 β －actin抗體(1∶2000)，4℃孵育過(guò)夜，再加入兔抗小鼠IgG(1∶5000)孵育1 h，最后經(jīng)ECL系統(tǒng)曝光顯影，通過(guò)凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá)。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS 8.1 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間均數(shù)比較用One－way ANOVA分析。

結(jié) 果

1 EPCs增殖率的檢測(cè)

與未加FFA組相比，隨著FFA濃度的增加，DM組和對(duì)照組EPCs增殖率均明顯下降，差異顯著(P＜0.05)。而相同F(xiàn)FA濃度下，DM組增殖率低于對(duì)照組(P ＜0.05)，見表1。

表1 不同濃度的FFA對(duì)DM組和對(duì)照組EPCs增殖率的影響Table 1.Proliferative rate of EPCs treated with various concentrations of FFA in diabetes mellitus(DM)group and control group(%.)

表1 不同濃度的FFA對(duì)DM組和對(duì)照組EPCs增殖率的影響Table 1.Proliferative rate of EPCs treated with various concentrations of FFA in diabetes mellitus(DM)group and control group(%.)

＊＊P ＜0.01 vs FFA 0 mmol/L;△△P ＜0.01 vs control.

Group FFA(mmol/L)n 10 50 Control 20 17.8 ±3.2 14.3 ±3.7＊＊ 9.4 ±2.60＊＊DM 32 15.2 ±3.1 10.4 ±3.5＊＊△△ 5.5 ±2.4＊＊△△

2 EPCs凋亡的檢測(cè)

隨著FFA濃度的增加，DM組和對(duì)照組EPCs早期和晚期凋亡率均增加，差異顯著(P＜0.05)。而相同F(xiàn)FA濃度下，DM組早期和晚期凋亡率亦高于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)，見表2。

表2 不同濃度的FFA對(duì)DM組和對(duì)照組EPCs凋亡率的影響Table 2.Apoptotic rates of EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group and control group(%.)

表2 不同濃度的FFA對(duì)DM組和對(duì)照組EPCs凋亡率的影響Table 2.Apoptotic rates of EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group and control group(%.)

＊＊P ＜0.01 vs FFA 0 mmol/L;△P ＜0.05 vs control.

Group n Apoptotic FFA(mmol/L)10 50 Control 20 Early 3.6 ±1.6 5.5 ±3.0＊＊ 11.3 ±6.1 type 0＊＊Late 4.7 ±2.4 6.3 ±3.6＊＊ 10.2 ±3.2＊＊DM 32 Early 4.1 ±2.0 6.5 ±2.8＊＊ 14.5 ±5.4＊＊△Late 3.2 ±1.1 8.8 ±3.4＊＊△ 12.3 ±5.0＊＊△

3 FOXO1的mRNA和蛋白表達(dá)

RT－PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著FFA濃度的增加，DM組和對(duì)照組FOXO1的mRNA表達(dá)逐漸降低，差異顯著(P＜0.05)，見表3、圖1。Western blotting法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著FFA濃度的增加，F(xiàn)OXO1蛋白表達(dá)逐漸下降，見表4、圖2。

表3 不同濃度的FFA對(duì)DM組和對(duì)照組EPCs中FOXO1 mRNA表達(dá)的影響Table 3.Expression of FOXO1 mRNA in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group and control group()

表3 不同濃度的FFA對(duì)DM組和對(duì)照組EPCs中FOXO1 mRNA表達(dá)的影響Table 3.Expression of FOXO1 mRNA in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group and control group()

＊＊P ＜0.01 vs FFA 0 mmol/L.

FFA(mmol/L)Group n 10 50 Control 20 0.90 ±0.11 0.65 ±0.09＊＊ 0.41 ±0.140＊＊DM 32 0.80 ±0.13 0.52 ±0.11＊＊ 0.31 ±0.20＊＊

Figure 1.Expression of FOXO1 mRNA in EPCs treated with various concentrations of FFA(Lane 1，4:0 mmol/L;Lane 2，5:10 mmol/L;Lane 3，6:50 mmol/L)in control group(Lane 1－3)and DM group(Lane 4－6).M:100 bp DNA marker from 100 to 600 bp.圖1 不同濃度的FFA對(duì)EPCs中FOXO1 mRNA表達(dá)的影響

表4 不同濃度的FFA對(duì)DM組EPCs中FOXO1蛋白表達(dá)的影響Table 4.Expression level of FOXO1 protein in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group(.n=32)

表4 不同濃度的FFA對(duì)DM組EPCs中FOXO1蛋白表達(dá)的影響Table 4.Expression level of FOXO1 protein in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group(.n=32)

*P ＜0.05 vs FFA 0 mmol/L.

FFA(mmol/L) FOXO1/β－actin 0.85 ±0.1710 0.47 ±0.15*50 0.22 ±0.120*

Figure 2.Expression of FOXO1 protein in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group.圖2 不同濃度的FFA對(duì)DM組EPCs中FOXO1蛋白表達(dá)的影響

討 論

本研究將FFA作用于糖尿病患者EPCs，觀察對(duì)其增殖、凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA可抑制EPCs增殖，促進(jìn)其凋亡，且這些作用具有劑量依賴性。FFA是細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和前列腺素合成的供體，也是脂肪代謝的中間產(chǎn)物。許多研究表明高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗在糖尿病的發(fā)生中起到重要作用［3］，但FFA與糖尿病周圍血管病的關(guān)系研究較少。而糖尿病周圍血管病作為糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，其發(fā)生與EPCs關(guān)系密切［4］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)FA可抑制EPCs的增殖，在糖尿病周圍血管病的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。

在脂肪和肌肉組織中，過(guò)氧化物酶增殖體激活受體(peroxisome proliferator－ activated receptors，PPAR)家族和FOXO家族是維持血糖穩(wěn)定和胰島素敏感性的2個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子家族［5］。FOXO轉(zhuǎn)錄因子位于細(xì)胞核內(nèi)，在沒(méi)有胰島素存在情況下能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖合成關(guān)鍵酶的合成，而在胰島素的作用下，通過(guò)磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3 －kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)途徑，磷酸化后移出細(xì)胞核，阻斷其促進(jìn)葡萄糖生成酶的作用，從而中止葡萄糖的合成［6］。FOXO轉(zhuǎn)錄因子還在氧化應(yīng)激［7－9］和清除自由基方面發(fā)揮作用［10，11］，其下游基因包括保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化的錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)等［12］。2 型糖尿病患者體內(nèi)一般存在高FFA，這種狀態(tài)對(duì)糖尿病患者的心肌細(xì)胞功能可造成不良影響［13］，還有報(bào)道高FFA可抑制脂肪細(xì)胞表達(dá)FOXO1［14］，但對(duì)EPCs的作用尚未見報(bào)道。

為此，我們研究了在高FFA作用下EPCs表達(dá)FOXO1的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著FFA濃度的增加，EPCs中FOXO1的表達(dá)逐漸減低。FFA增加，線粒體內(nèi)游離自由基的合成也隨之增加，氧化應(yīng)激增強(qiáng);同時(shí)FOXO1表達(dá)減弱，下游清除自由基的分子如MnSOD合成減少，兩方面綜合作用，可能損害EPCs。還有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO的功能與周圍血管功能密切相關(guān)。當(dāng)缺乏FOXO時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞失去了對(duì)VEGF的反應(yīng)性［15］，且血管平滑肌細(xì)胞持續(xù)增殖，使血管壓力增高，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損［16］。本研究結(jié)果還提示，高 FFA情況下，EPCs的凋亡也增加，因此FOXO表達(dá)減弱是由于EPCs凋亡增加引起，還是由于FFA的直接作用，尚待進(jìn)一步探討。

［1］Ishikawa M，Asahara T.Endothelial progenitor cell culture for vascular regeneration［J］.Stem Cells Dev，2004，13(4):344－349.

［2］王紅祥，趙 湜，李賓公，等.高糖對(duì)糖尿病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖凋亡的影響及其機(jī)制探討［J］.中國(guó)病理生理雜志，2007，23(11):2210－2213.

［3］Ohmura E，Hosaka D，Yazawa M，et al.Association of free fatty acids(FFA)and tumor necrosis factor－α(TNF－ α)and insulin － resistant metabolic disorder［J］.Horm Metab Res，2007，39(3):212 －217.

［4］Loomans CJ，de Koning EJ，Staal FJ，et al.Endothelial progenitor cell dysfunction:a novel concept in the pathogenesis of vascular complications of type 1 diabetes［J］.Diabetes，2004，53(1):195－199.

［5］Armoni M，Harel C，Karnieli E.Transcriptional regulation of the GLUT4 gene:from PPAR－γ and FOXO1 to FFA and inflammation［J］.Trends Endocrinol Metab，2007，18(3):100－107.

［6］Gross DN，Wan M，Birnbaum MJ.The role of FOXO in the regulation of metabolism［J］.Curr Diab Rep，2009，9(3):208－214.

［7］Furukawa－Hibi Y，Yoshida－Araki K，Ohta T，et al.FOXO forkhead transcription factors induce G2－M checkpoint in response to oxidative stress［J］.J Biol Chem，2002，277(30):26729－26732.

［8］Kops GJ，Dansen TB，Polderman PE，et al.Forkhead transcription factor FOXO3a protects quiescent cells from oxidative stress［J］.Nature，2002，419(6904):316 －321.

［9］Salih DA，Brunet A.FoxO transcription factors in the maintenance of cellular homeostasis during aging［J］.Curr Opin Cell Biol，2008，20(2):126 －136.

［10］Nemoto S，F(xiàn)ergusson MM，F(xiàn)inkel T.Nutrient availability regulates SIRT1 through a forkhead－dependent pathway［J］.Science，2004，306(5704):2105－2108.

［11］Furuyama T，Kitayama K，Yamashita H，et al.Forkhead transcription factor FOXO1(FKHR)－dependent induction of PDK4 gene expression in skeletal muscle during energy deprivation［J］.Biochem J，2003，375(Pt 2):365－371.

［12］Schuur ER，Loktev AV，Sharma M，et al.Ligand－dependent interaction of estrogen receptor－α with members of the forkhead transcription factor family［J］.J Biol Chem，2001，276(36):33554 －33560.

［13］Boudina S，Abel ED.Diabetic cardiomyopathy，causes and effects［J］.Rev Endocr Metab Disord，2010，11(1):31－39.

［14］Subauste AR，Burant CF.Role of FoxO1 in FFA －induced oxidative stress in adipocytes［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，293(1):E159－E164.

［15］Furuyama T，Kitayama K，Shimoda Y，et al.Abnormal angiogenesis in Foxo1(Fkhr)－deficient mice［J］.J Biol，Chem，2004，279(33):34741 －34749.

［16］Goettsch W，Gryczka C，Korff T，et al.Flow－dependent regulation of angiopoietin － 2［J］.J Cell Physiol，2008，214(2):491－503.