吳書一 ，劉文剛 ，董秀娟 ，羅明霞 ，葛永超 ，王志余 ，趙曉武 *

1.鄭州市第三人民醫(yī)院干細(xì)胞與器官移植實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450000；2.鄭州市第三人民醫(yī)院血液科，河南鄭州 450000；3.鄭州市第三人民醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州 450000

目前，腎臟移植已成為終末期腎病的有效治療手段之一，隨著新型免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，腎移植1年人/腎存活率已經(jīng)達(dá)到90%以上，但移植物長(zhǎng)期存活率沒有得到明顯改善。慢性排斥反應(yīng)和免疫抑制劑的不良反應(yīng)仍是影響腎移植長(zhǎng)期存活的主要因素[1]。誘導(dǎo)受體對(duì)移植腎特異性的免疫耐受可以減少排斥反應(yīng)的發(fā)生、減少免疫抑制劑用量，提高移植腎的長(zhǎng)期存活。目前，誘導(dǎo)免疫耐受的方法主要是供者特異性輸血和供者特異性造血干細(xì)胞移植[2]。本研究對(duì)48例腎移植受者進(jìn)行了非清髓性的供者特異性造血干細(xì)胞移植，并觀察其免疫功能變化，以探討其誘導(dǎo)免疫耐受、降低排斥反應(yīng)的可行性及安全性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集1998年1月～2005年12月在我院行供體特異性造血干細(xì)胞移植的腎移植患者48例，設(shè)為觀察組，患者均為女性，年齡20～48歲，平均34歲。收集同期接受同一供者另一腎臟的腎移植患者48例，設(shè)為對(duì)照組，患者均為女性，年齡22～49歲，平均36歲。供者為48例健康男性，年齡20～50歲，平均35歲。供、受者ABO/Rh血型相同，補(bǔ)體依賴性淋巴細(xì)胞毒交叉配型試驗(yàn)（CDC）≤10%，受者術(shù)前檢查群體反應(yīng)性抗體（PRA）均為陰性，依據(jù)氨基酸殘基配型原則，HLA-A、B、DRB1為1～2位點(diǎn)錯(cuò)配。供體熱缺血時(shí)間少于8 min，冷缺血時(shí)間少于8 h。

1.2 方法

1.2.1 骨髓采集、處理與移植 取腎的同時(shí)，于供者的雙側(cè)髂前、髂后上棘及胸骨部位，采集骨髓200～380 ml，ACD抗凝，經(jīng)過去除脂肪、血漿、部分紅細(xì)胞后濃縮為80～100 ml，加入等體積的細(xì)胞冷凍保護(hù)液，經(jīng)程序降溫后置-196℃液氮中保存。常規(guī)方法行腎移植，造血干細(xì)胞移植的預(yù)處理方案采用ATG（德國，F(xiàn)resenius，兔抗）3 mg/（kg·d），連用 5 d，腎移植術(shù)后第14天，將冷凍的骨髓于42℃水浴中快速復(fù)溫，立即輸注，輸注的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)為（0.9～2.5）×108/kg，臺(tái)盼藍(lán)拒染率為（93±4）%。

1.2.2 預(yù)防排異的治療方案 移植后應(yīng)用三聯(lián)免疫抑制劑環(huán)孢素 A 5 mg/（kg·d）[或普樂可復(fù) 0.1 mg/（kg·d）]、嗎替麥考酚脂1.5 mg/d、潑尼松30 mg/d。兩組隨訪1～10年，觀察急性排斥反應(yīng)發(fā)生率及5年人/腎存活率。所有受者均經(jīng)醫(yī)院倫理道德委員會(huì)討論批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2.3 標(biāo)本采集 于移植后第30、60、90、360天同一時(shí)間點(diǎn)留取外周血標(biāo)本：血清2 ml，肝素抗凝血4 ml。

1.2.4 試劑與儀器 抗 CD3、CD4、CD8、CD19、CD25 購自美國BD 公司（Becton，Dicki-nson and Company）；IL-10、TNF-α 細(xì)胞因子檢測(cè)試劑購自深圳晶美生物工程公司；主要儀器FACS Calibur流式細(xì)胞儀：美國BD公司，ELX800型酶標(biāo)分析儀（美國Bio-Tek公司）

1.2.5 檢測(cè)方法 應(yīng)用流式細(xì)胞儀直接免疫標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群，T 淋巴細(xì)胞選擇 CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+，B淋巴細(xì)胞選擇CD19+。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10、TNF-α。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，百分率比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

移植后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，觀察組CD3+、CD4+、CD19+細(xì)胞百分比及TNF-α濃度持續(xù)降低，與對(duì)照組相比，60 d后CD3+、CD4+、CD19+下降最明顯（P<0.05），之后穩(wěn)定在一個(gè)水平；觀察組CD8+降低不明顯，但CD4+/CD8+比值明顯降低；觀察組CD4+CD25+百分比及IL-10濃度持續(xù)升高，與對(duì)照組相比，CD4+CD25+百分比90 d時(shí)升高最明顯 （P<0.05），IL-10濃度30 d時(shí)升高最為明顯（P<0.05）。結(jié)果見表1。

表1 觀察組與對(duì)照組，移植后不同時(shí)間段免疫學(xué)指標(biāo)變化的比較（±s，n=48）

表1 觀察組與對(duì)照組，移植后不同時(shí)間段免疫學(xué)指標(biāo)變化的比較（±s，n=48）

注：移植后同一時(shí)間段，與對(duì)照組相比，*P<0.05

兩組急性排斥反應(yīng)發(fā)生率：觀察組為12%，低于對(duì)照組（29%），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨訪5年人/腎存活率，觀察組為100%/100%，對(duì)照組為100%/88%。

3 討論

非清髓性供體特異性造血干細(xì)胞移植是指在腎移植后通過相對(duì)較經(jīng)典、預(yù)處理強(qiáng)度較低的非清髓性誘導(dǎo)治療來抑制受者的免疫應(yīng)答，使供者造血干細(xì)胞在受體內(nèi)得以植入，再經(jīng)過免疫抑制劑應(yīng)用，以期達(dá)到宿主和移植物之間的雙向免疫耐受，提高腎移植患者長(zhǎng)期存活率。Spitzer等[3]報(bào)道1例多發(fā)性骨髓瘤繼發(fā)腎功能衰竭患者，經(jīng)環(huán)磷酰胺、抗胸腺細(xì)胞球蛋白（ATG）和胸腺照射處理后，采取HLA配型相合的骨髓聯(lián)合腎臟移植，術(shù)后2個(gè)月停用免疫抑制劑，腎功能正常，無排斥反應(yīng)發(fā)生。Kawai等[4]報(bào)道，腎移植聯(lián)合骨髓輸注患者5例，移植后9～14個(gè)月停用免疫抑制劑，移植腎功能仍保持穩(wěn)定2～5年。傅耀文等[5]報(bào)道61例腎移植后接受供者特異性骨髓輸注，可以誘導(dǎo)嵌合體發(fā)生，提高受者對(duì)供者的免疫耐受，降低排斥反應(yīng)發(fā)生率。王志余等[6]報(bào)道3例活體親屬腎移植，首先對(duì)供體進(jìn)行外周血?jiǎng)訂T，采集外周血干細(xì)胞，于腎移植后2周分次輸注，能更好地促進(jìn)微嵌合形成，更有利于產(chǎn)生免疫耐受。

本文主要觀察供體特異性造血干細(xì)胞移植對(duì)腎移植受者免疫功能的影響，探討免疫耐受及排斥反應(yīng)發(fā)生情況。T細(xì)胞亞群主要分為CD4陽性輔助性T細(xì)胞和CD8陽性抑制性T細(xì)胞。CD4輔助性T細(xì)胞（Th）又分為Th1和Th2細(xì)胞，能介導(dǎo)免疫應(yīng)答，分泌多種具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性、多功能低分子蛋白即細(xì)胞因子，在移植免疫中發(fā)揮重要作用。Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（IL-2、TNF-α等）能促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，激活天然殺傷細(xì)胞，特異性殺傷移植物抗原，啟動(dòng)排斥反應(yīng)。Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（IL-10等）是一種強(qiáng)有力的免疫抑制和炎癥抑制因子，抑制免疫排斥和炎癥的發(fā)生。Th1和Th2細(xì)胞間動(dòng)態(tài)平衡對(duì)誘導(dǎo)和維持免疫耐受十分重要[7]。因此，腎移植受者T細(xì)胞亞群和T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子檢測(cè)，一定程度上反映了T細(xì)胞的活化程度，幾種不同的細(xì)胞因子聯(lián)合檢測(cè)可反映不同輔助性T細(xì)胞亞群的活化狀態(tài)。

移植后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，觀察組CD3+、CD4+細(xì)胞百分比持續(xù)降低，與對(duì)照組相比，60 d 后 CD3+、CD4+下降最明顯（P<0.05），之后穩(wěn)定在一個(gè)水平；觀察組CD8+降低不明顯，但CD4+/CD8+比值明顯降低，表明受者免疫功能處于明顯的免疫抑制狀態(tài)，有利于降低排斥反應(yīng)的發(fā)生。CD4+CD25+調(diào)控T細(xì)胞具有免疫抑制及誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞成為免疫無能兩大功能特征，是機(jī)體維持自身耐受的重要組成部分，其對(duì)免疫反應(yīng)具有抑制效應(yīng)[6]。觀察組CD4+CD25+持續(xù)升高，與對(duì)照組相比，90 d時(shí)升高最明顯（P<0.05），提示受者形成免疫耐受，呈現(xiàn)低免疫反應(yīng)狀態(tài)；IL-10為Th2細(xì)胞分泌的抑制性細(xì)胞因子，觀察組IL-10持續(xù)升高，與對(duì)照組相比，30 d時(shí)升高最為明顯 （P<0.05），也提示受者免疫功能受到抑制。TNF-α為Th1細(xì)胞分泌的促炎癥因子和免疫抑制因子，觀察組 TNF-α持續(xù)降低，與對(duì)照組相比，60 d時(shí)降低最為明顯（P<0.05），提示可減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生，降低排斥反應(yīng)，受者免疫功能受到進(jìn)一步抑制。CD19+是B淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志，觀察組CD19+持續(xù)降低，與對(duì)照組相比，60 d時(shí)下降最明顯（P<0.05），之后穩(wěn)定在一個(gè)水平，提示B淋巴細(xì)胞功能受到抑制，從而可以減少排斥性抗體的分泌，降低排斥反應(yīng)的發(fā)生率。隨訪結(jié)果表明，觀察組急性排斥反應(yīng)發(fā)生率明顯低于對(duì)照組（12%vs 29%，P<0.05）；5 年人/腎存活率，觀察組高于對(duì)照組（100%/100%vs 100%/88%）。

本研究發(fā)現(xiàn)，盡管觀察組與對(duì)照組都使用了免疫抑制劑環(huán)孢素A，但從免疫重建結(jié)果來看，觀察組的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、IL-10明顯增多，與環(huán)孢素A參與免疫抑制IL-2、TNF-α分泌減少的藥理機(jī)制無關(guān)。顯然輸注同一供者骨髓干細(xì)胞，可以通過抑制性T細(xì)胞克隆的增加，改變了受體免疫重建后的淋巴細(xì)胞群系，從而可能誘導(dǎo)了受體的免疫耐受。

本組結(jié)果提示供體特異性造血干細(xì)胞移植能夠抑制腎移植受者CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞免疫功能，使患者處于低免疫反應(yīng)狀態(tài)；增強(qiáng)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能，有利于誘導(dǎo)免疫耐受；同時(shí)，又能夠抑制B淋巴細(xì)胞，減少排斥性抗體的分泌，降低排斥反應(yīng)發(fā)生率，對(duì)提高人/腎存活率具有重要作用。

筆者認(rèn)為，供體特異性造血干細(xì)胞移植是一種安全、有效地誘導(dǎo)腎移植免疫耐受的臨床治療方法，能夠降低排斥反應(yīng)的發(fā)生，其更深層次的免疫機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

[1]董磊,段美麗,李昂.腎移植術(shù)后不同階段感染病原學(xué)特征分析[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,5(4):308-310.

[2]黃君齡,王祥慧.供者特異性輸注誘導(dǎo)腎移植受者免疫耐受的研究進(jìn)展[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2009,29(7):877-881.

[3]Spitzer TR,Delnonico F,Tolkoff-Rubin N,et al.Combined histocompatibility leukocyte antigen-matched donor bone marrow and renal transplantation for multiple myeloma with end stage renal disease:the induction of allograft tolerance through mixed lymphohe-matopoietic chimerism[J].Transplantation,1999,68(4):480-484.

[4]KawaiT,CosiniAB,SpitzerTR,etal.HLA-mismatchedrenaltransplantation without maintenance immunosuppression[J].N Engl J Med,2008,358(4):353-361.

[5]傅耀文,王偉剛,周洪瀾,等.腎骨髓聯(lián)合移植與嵌合體發(fā)生及急性排斥反應(yīng)的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(23):1983-1985.

[6]王志余,葛永超,趙曉武,等.腎-骨髓聯(lián)合移植誘導(dǎo)免疫耐受:能夠促進(jìn)移植后嵌合體的形成嗎？[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(53):10457-10460.

[7]何維.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:188-205.