陳 琪

廣東省藥品檢驗所藥理室，廣東廣州 510180

熱原檢查實質(zhì)上就是內(nèi)毒素的限量檢查。鱟試劑法對內(nèi)毒素檢查具有專一、靈敏、快速簡便的特點，但目前藥典規(guī)定的品種尚有限，因此，擴大應(yīng)用成了廣大藥檢人員普遍重視的問題[1]。本文根據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄XI E“細菌內(nèi)毒素檢查法”[2]中所述的藥品細菌內(nèi)毒素的檢查方法及其干擾試驗的基本原理，對注射用法莫替丁的細菌內(nèi)毒素檢查可否限值提高進行了探索性研究，文中提供了分別來自同一廠家的3批供試品在兩個廠家鱟試劑下的干擾試驗數(shù)據(jù)，證實了本品種細菌內(nèi)毒素檢查限值提高的可行性。同時，運用相同的方法檢查了不同廠家的17批供試品，檢查結(jié)果均合格?，F(xiàn)將研究過程報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 實驗材料及藥品

細菌內(nèi)毒素檢查用鱟試劑（購于廣東湛江安度斯生物有限公司，批號：1008202，靈敏度：0.125 EU/ml，規(guī)格：0.1 ml/支），細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，購于廣東湛江安度斯生物有限公司，批號：1003080，規(guī)格：5.0 ml/支）；細菌內(nèi)毒素檢查用鱟試劑 （購于廣東湛江博康海洋生物有限公司，批號：1009030，靈敏度：0.125 EU/ml，規(guī)格：0.1 ml/支）。 細菌內(nèi)毒素標準品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：150601-200968，效價：150 EU/支）。注射用法莫替丁（哈藥集團三精加濱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20100111、20100303、20100312）。

1.2 儀器

旋渦振蕩器（IKA-MS-1）；恒溫水浴箱（德國 Julabo 19A）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）的復(fù)核

上述兩個批號鱟試劑經(jīng)由細菌內(nèi)毒素標準品標定，結(jié)果均在 0.5λb～2.0λb（λb為標準靈敏度）之間，符合相關(guān)規(guī)定，可用于實驗。

2.2 樣品細菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

參考《中國藥典》2010年版二部附錄XI E“細菌內(nèi)毒素檢查法”[2]，參考注射用法莫替丁的臨床實際應(yīng)用情況，本品成人臨床日常用量為每天40 mg/60 kg，根據(jù)公式L＝K/M，其中K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑 K＝5 EU/（kg·h）；M 為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以 ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或 U/（kg·h）表示，人均體重按60 kg計算，注射時間不足1 h，按1 h計算。 將本品細菌內(nèi)毒素限值確定為 L=5 EU/（kg·h）/（40 mg/60 kg）＝7.5 EU/mg。

2.3 最小有效稀釋濃度（C）的確定

限值L考慮為7.5 EU/mg時，根據(jù)公式C＝λ/L，當選用鱟試劑靈敏度為λ＝0.125 EU/ml時，供試品溶液中法莫替丁的最小有效稀釋濃度為C=λ/L＝0.017 mg/ml。

2.4 供試品干擾預(yù)實驗

選取靈敏度為0.125 EU/ml的細菌內(nèi)毒素檢查鱟試劑，對1個廠家的供試品進行稀釋檢驗，稀釋濃度分別為0.060、0.030、0.020、0.008、0.004 mg/ml，具體過程如下：取本品 20 mg（1瓶）加細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解并稀釋至2 ml（濃度為10 mg/ml），取稀釋液0.1ml加細菌內(nèi)毒素檢查用水至2.0 ml（濃度為0.5 mg/ml），取稀釋液0.3 ml加細菌內(nèi)毒素檢查用水至2.5 ml（濃度為0.060 mg/ml），取稀釋液0.5 ml加細菌內(nèi)毒素檢查用水至1.0 ml（濃度為0.030 mg/ml），取濃度為0.06 mg/ml的稀釋液0.2 ml加細菌內(nèi)毒素檢查用水至0.6 ml（濃度為0.020 mg/ml），取濃度為0.06 mg/ml的稀釋液0.4 ml加細菌內(nèi)毒素檢查用水至3.0 ml（濃度為0.008 mg/ml），取濃度為0.008 mg/ml的稀釋液0.5 ml加細菌內(nèi)毒素檢查用水至1.0 ml（濃度為 0.004 mg/ml）。

試驗中另設(shè)陽性對照（PC）和陰性對照（NC），每個濃度平行做2管，結(jié)果見表1。

表1 供試品（批號：20100312）干擾預(yù)試驗結(jié)果

由表1可見供試品在各個稀釋濃度對鱟試劑檢查均無干擾作用。

2.5 供試品干擾試驗

取同一廠家的3批注射用法莫替丁，用細菌內(nèi)毒素檢查用水進行稀釋，終濃度為0.017 mg/ml，選用兩個廠家靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行干擾試驗，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，Es值均落在0.5λ～2.0λ之間 （λ為所選用鱟試劑的靈敏度，取值0.125 EU/ml），且相應(yīng)的Et/Es比值均在0.5～2.0之間；這一結(jié)果說明注射用法莫替丁在稀釋濃度為0.017 mg/ml或更小時對細菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。

表2 干擾試驗結(jié)果

2.6 供試品細菌內(nèi)毒素檢查

本品共17批，按 《中國藥典》2010年版二部附錄XI E“細菌內(nèi)毒素檢查法”[2]，分別進行細菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表3。

由表3可見供試品注射用法莫替丁在稀釋至濃度為0.017 mg/ml及以下時對細菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。本研究中將注射用法莫替丁的細菌內(nèi)毒素檢查限值定為：每毫克法莫替丁中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于7.5 EU。對17批樣品分別按擬訂標準進行檢驗，其細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

3 討論

注射劑安全評價中是否可用細菌內(nèi)毒素檢查實驗來檢測其熱原質(zhì)，應(yīng)視該注射劑對細菌內(nèi)毒素實驗是否存在干擾及這種干擾能否排除的情況而定[3-7]。由試驗結(jié)果可見，注射用法莫替丁在稀釋至濃度為0.017 mg/ml時對上述兩個廠家的鱟試劑和細菌內(nèi)毒素標準品之間的反應(yīng)均無干擾作用。

一般情況下，供試品對細菌內(nèi)毒素檢查的干擾作用程度與供試品濃度呈正性相關(guān)[4]。由本研究結(jié)果可見注射用法莫替丁在稀釋濃度為0.060 mg/ml時對細菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。若將內(nèi)毒素限值擬定為7.5 EU/mg，選用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行細菌內(nèi)毒素檢查，則供試品的最小有效稀釋濃度為0.017 mg/ml。由于供試品對細菌內(nèi)毒素檢查的干擾作用程度與供試品濃度呈正性相關(guān)[8-10]，本供試品在進行細菌內(nèi)毒素檢查時可稀釋的濃度范圍較大，進而證實了本研究中所用方法的可靠性與可行性。

本研究針對國家藥典委員會《關(guān)于注射劑標準起草與復(fù)核工作的要求》對注射用法莫替丁的現(xiàn)行標準進行了提高工作，進一步減小了本品種細菌內(nèi)毒素檢查的限值。注射用法莫替丁原質(zhì)量標準載于國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準[WS1-（X-040）-2004Z]，該標準中規(guī)定注射用法莫替丁的細菌內(nèi)毒素限值為每毫克中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于15 EU。本研究根據(jù)注射用法莫替丁最大臨床日用量，確定其細菌內(nèi)毒素限值為每毫克法莫替丁中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于7.5 EU，并對哈藥集團三精加濱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的3批注射用法莫替丁進行了細菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗，結(jié)合對樣品的檢驗結(jié)果，擬定了注射用法莫替丁的細菌內(nèi)毒素檢查標準。對內(nèi)毒素限值的進一步提高，有利于更好地控制藥品質(zhì)量，為醫(yī)院用藥安全提供更高的保障。

表3 注射用法莫替丁細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

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