王立鋒

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 蘇州 215007；2.上海市瑞金醫(yī)院分院（上海市閔行中心醫(yī)院）婦產(chǎn)科，上海 201100

宮頸癌作為一種危害婦女健康的嚴重疾病，目前在婦女中其發(fā)病率則僅次于乳腺癌的發(fā)病率，位于婦女惡性腫瘤發(fā)病的第2位，每年全世界約有50萬新發(fā)病例，25萬死亡病例，其中發(fā)展中國家占2/3。我國是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，占全球?qū)m頸癌總數(shù)的10%[1-5]。研究證實，人乳頭狀瘤病毒（HPV）是引起婦女宮頸癌及癌前病變發(fā)病的致病病毒；研究證實子宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者多數(shù)伴HPV感染，調(diào)查發(fā)現(xiàn)婦女宮頸癌患者標本中HPV-DNA的可檢出率為90.0%～99.7%，特別是那些高危型HPV感染。國際癌癥研究組織（IARC）對世界25個國家（不包括東亞地區(qū)）的宮頸癌標本的研究發(fā)現(xiàn)了15種高危型HPV，而與我國宮頸癌密切相關(guān)主要病毒類型依次為HPV16、HPV58和HPV18，HPV58是我國、日本、朝鮮等東亞地區(qū)高發(fā)病毒流行株[6-9]。所以對存在CIN患者進行高危型HPV感染的篩查檢測在臨床上對于早期預(yù)防及發(fā)現(xiàn)宮頸癌具有十分重要的臨床意義。第二代雜交捕獲法（HCⅡ）是目前被FDA唯一批準的HPV感染檢測方法，其具有能同時檢測13種高危型HPV感染的方法。近年來，一種新的DNA檢測技術(shù)實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（real-time PCR）檢測獲得很大的發(fā)展，realtime PCR檢測高危型HPV DNA具有試驗操作簡便，在擴增高危型HPV時結(jié)合了核酸特異型探針以進行雜交，該方法提高了實驗室檢測的敏感性及特異性[10-12]。本研究采用realtime PCR和HCⅡ技術(shù)來分別檢測100例行液基細胞薄層涂片技術(shù)（TCT）≥低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL），未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）患者宮頸標本中的高危亞型HPV，探討兩種檢測方法的優(yōu)缺點及其不同CIN程度的高危型HPV的檢出率，并探討兩種高危HPV檢測方法在宮頸癌篩查中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

標本來源于2011年1～6月在上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科行液基細胞薄層涂片技術(shù)（LCT）≥未明確診斷意義的ASCUS患者100例。檢查者按細胞學(xué)分類，ASCUS 48例，LSIL 36例，高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）16例。分別采用realtime PCR與HCⅡ檢測高危型HPV。及時將臨床采集的標本送檢，按照操作流程預(yù)處理臨床采集的標本后置于低溫冰箱保存待檢。所有患者均對研究知情。

1.2 儀器與試藥

高危型HPV實時熒光PCR臨床檢測試劑盒均由上海復(fù)星診斷有限公司所提供；采用Line-Gene FQIN33 A型realtime-PCR儀進行DNA檢測；HCⅡ基因雜交信號擴大系（美國Digene公司）、HPV-DNA試劑盒（美國Digene公司）、微孔板封面膠膜（Xygen公司）、子宮頸采樣器（含保存液）（美國Digene公司）、圓底96孔酶標板（Xygen公司）。

1.3 實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測方法

不同引物和探針（5'端和3'端分別標有熒光報告基團和熒光淬滅基團），只在相應(yīng)型別模板的型特異性堿基區(qū)域與模板發(fā)生相互作用，PCR擴增時，兼有5'-3'核酸外切酶活性的Taq酶將探針降解，熒光報告基團脫離熒光淬滅基團的作用，熒光信號逐漸增強，由定量PCR儀的熒光監(jiān)測系統(tǒng)對標本的熒光信號進行實時動態(tài)檢測，確定模板的型別。realtime PCR法高危型HPV檢測反應(yīng)試劑盒可分辨13種高危型 HPV 型別（包括 16、18、31、33、35、39、32、52、56、58、59、68）。具體操作流程按試劑盒說明書指示的步驟進行操作。其操作流程包括如下步驟：①提取樣本DNA。②配制real-time PCR反應(yīng)液：將每1份樣本標本分別分裝到13個PCR反應(yīng)管中以分別檢測13種高危型HPV型別。③樣本實時熒光PCR擴增與檢測：擴增過程為50℃反應(yīng)進行2 min，在94℃條件下進行DNA變性2進入PCR反應(yīng)循環(huán)，循環(huán)溫度及時間程序為 93℃，20 s，50℃，90 s，共計 40 個反應(yīng)循環(huán)，反應(yīng)溫度降至50℃時檢測反應(yīng)熒光值。④對反應(yīng)結(jié)果進行判斷分析。

1.4 第二代雜交捕獲檢測方法

HCⅡ可同時檢測 13種高危型HPV（包括 16、18、31、33、35、39、32、52、56、58、59、68），按照試劑上所述的操作步驟進行，其具體操作步驟如下：將DNA雙鏈解鏈為單鏈DNA；將解鏈的DNA和RNA探針進行雜交，生成RNA-DNA雜交體；RNA-DNA雜交體和微孔壁上固定的特異性抗體相結(jié)合；結(jié)合的抗體進行磷酸化反應(yīng)將信號放大；底物在堿性磷酸酶的作用下發(fā)光，利用讀數(shù)器讀取發(fā)光的強弱來判定微孔壁上堿性磷酸酶的含量，進而得出特異性結(jié)合的RNA-DNA雜交體的具體含量；最后進行反應(yīng)結(jié)果的讀取，判斷標準：HPV負荷量≥1.0 pg/ml，則定義為HPV感染陽性。

1.5 病理判斷

陰道鏡下多點活檢病理學(xué)檢測：對于檢測HPV陽性，或HPV陰性但TCT≥LSIL的病例均行陰道鏡下多點活檢或頸管診刮。病理學(xué)家在完全不知道TCT和HPV結(jié)果的情況下盲法閱片做出診斷。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所以統(tǒng)計分析處理均采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進行，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人乳頭瘤病毒檢出率及不同程度宮頸病變兩種人乳頭瘤病毒檢出狀況

本組診斷CIN 35例，CIN現(xiàn)患率為35%（35/100），其中，≥CINⅡ 16例，占16%（16/100）。68例病理結(jié)果以及兩種HPV檢出情況見表1。

表1 兩種方法檢測不同程度宮頸病變中人乳頭瘤病毒陽性率比較[n（%）]

2.1 兩種方法檢測宮頸病變的符合率

兩種方法的總符合率為82.3%，Kappa指數(shù)為0.579，見表2。

表2 兩種方法檢測宮頸病變符合率比較（例）

2.2 兩種方法檢測高危型人乳頭瘤病毒的陽性率比較

HCⅡ和real-time PCR檢測高危型HPV的陽性率分別為63.0%（63/100）和71.0%（71/100），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 兩種人乳頭瘤病毒檢測方法的評價

以病理結(jié)果為參照標準，評價兩種HPV檢測方法對預(yù)測高度CIN（CINⅡ以上病變）的臨床價值，其臨床評價指標見表3。

3 討論

宮頸癌是威脅婦女健康的主要惡性腫瘤之一，目前發(fā)現(xiàn)的HPV基因型有100余種，大約40種涉及生殖道感染，約20種與腫瘤發(fā)生有關(guān)。依據(jù)HPV致病能力的不同，HPV可分為低危型和高危型，當(dāng)前的流行病學(xué)數(shù)據(jù)證實，宮頸癌及其癌前病變發(fā)病的主要病因為高危型HPV的持續(xù)感染所致。 低危型 HPV，如 HPV6、11、42、43、44 等常引起外生殖器濕疣等良性病變和宮頸上皮內(nèi)低度病變（CINⅠ）；高危型HPV包 括 HPV16、18、31、33、39、45、51、52、56、58、59、68、73 等 ，研究證實這些型別的HPV持續(xù)感染與官頸病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是HPV16和18型的致癌力最強[13-14]。在我國，現(xiàn)有的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明我國婦女宮頸癌的發(fā)病率明顯高于發(fā)達國家。而研究證實約90%以上的宮頸癌患者在其宮頸組織標本種均可檢測到高危型HPV[15-16]。

表3 兩種人乳頭瘤病毒檢測方法對預(yù)測高度子宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的臨床評價指標（%）

HC-Ⅱ技術(shù)是由FDA認證的用于宮頸癌普查的惟一非放射性檢測高危型HPV型別輔助診斷方法（美國Digene公司），目前，一系列研究證實第二代雜交捕獲法擁有很高的特異性和敏感性，其具有可一次性同時對一份宮頸樣本檢測13種導(dǎo)致高危宮頸病變的高危型HPV型別，該方法具有操作簡單、檢測效率高且成本較低廉的優(yōu)點。研究證實在進行特異性高危型HPV感染發(fā)病危險性的群體流行病學(xué)調(diào)查研究基礎(chǔ)上方能進行正規(guī)的宮頸癌發(fā)病的篩查，但是、當(dāng)前臨床上存在關(guān)于HPV基因分型型別試驗并不統(tǒng)一，目前關(guān)于檢測的金標準尚缺乏，因此給比較不同課題組之間將研究結(jié)果進行比較帶來了很大的困難和不便[17]。

Real-time PCR技術(shù)是近年快速發(fā)展的一種DNA檢測新技術(shù)，該技術(shù)的原理為在常規(guī)PCR原理基礎(chǔ)之上使用熒光基團標記的探針（雙熒光標記標記的兩個熒光基因——報告基因及淬滅基因）來解決常規(guī)PCR在進行DNA擴增時由于樣本易污染所產(chǎn)生的假陽性問題，該方法使得DNA檢測的特異性得到很大的提高。多重實時熒光PCR核酸檢測技術(shù)能同時對宮頸標本檢測13種導(dǎo)致高危宮頸病變的高危型HPV型別，該技術(shù)在那些存在低拷貝數(shù)宮頸脫落細胞標本進行高危型HPV型別檢測方面存在一定優(yōu)勢[18-19]。

若確定兩種方法檢測的真假陽性可經(jīng)直接測序法進行評價。本文為分析其對高度CIN的臨床預(yù)測價值，故以臨床病理結(jié)果作為評價的參照。在本研究中，筆者分別利用HCⅡ技術(shù)與real-time PCR檢測100例行TCT≥未明確診斷意義的ASCUS患者宮頸標本中的HPV高危亞型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCⅡ和real-time PCR檢測高危型HPV的陽性率分別為63.0%和71.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩種方法的符合率為 82.3%，Kappa指數(shù)為0.579。HCⅡ和 real-time PCR對高危型HPV感染的診斷敏感性分別為86.2%和91.7%，特異性分別為92.3%和98.9%。HCⅡ檢測高危HPV對宮頸高度病變的敏感性、特異性、準確性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比和陰性似然比分別為79.3%、88.2%、91.2%、10.1%、99.7%、8.9和 0.327；real-time PCR 以上各指標分別為 100.0%、92.5%、86.7%、8.6%、100.0%、8.7和 0。 結(jié)果顯示，real-time PCR與HCⅡ檢測宮頸上皮內(nèi)瘤變患者高危型HPV有較好的相關(guān)性；但real-time PCR檢測高危型HPV具有更好的敏感性和特異性。本研究結(jié)果顯示，HCⅡ的陽性似然比為8.9，高于real-time PCR（8.7），即HCⅡ檢測正確判斷子宮頸高度病變的機會是錯誤判斷為非高度病變的8.9倍，而real-time PCR為8.7倍。陰性似然比是該篩查方法錯誤判斷陰性的可能性是正確判斷陰性的可能性的多少倍，real-time PCR為0，而HCⅡ的陰性似然比為0.327，兩種檢測方法的陰性似然比都較小。

總之，對CIN患者宮頸組織標本進行高危HPV亞型檢測是十分必要的，real-time PCR與HCⅡ能有效檢測CIN患者高危型HPV，能及早發(fā)現(xiàn)及早干預(yù)，提高患者的預(yù)后。

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