江 紅 匡洪宇 馬麗麗 朱雪磊 段 鵬 康英英

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（黑龍江哈爾濱150001）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病最常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，可導(dǎo)致失明。其發(fā)病機制尚不明確，研究認(rèn)為在DR中早期周細胞丟失是周細胞發(fā)生了凋亡，氧化應(yīng)激可能誘導(dǎo)周細胞的凋亡。目前研究認(rèn)為氧化應(yīng)激是高糖誘導(dǎo)周細胞胞凋亡的中心環(huán)節(jié)[1]。本實驗通過研究高濃度葡萄糖下培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜微血管周細胞凋亡情況，探討黃芪有效部位的提取物——黃芪總黃酮對牛視網(wǎng)膜微血管周細胞凋亡及凋亡基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物 取黃芪10kg，以95%乙醇減壓回流提取3次，合并，濃縮至浸膏，取浸膏加蒸餾水溶解，用醋酸乙酯萃取數(shù)次，合并萃取液，濃縮，過柱，得總黃酮，提取物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)實驗室鑒定。臨用前以磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至所需濃度。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（低糖，美國Hyclone公司），優(yōu)級胎牛血清（天津灝洋生物公司），膠原酶Ⅱ型（美國Invitrogen公司），雙抗（大連美羅大藥廠），胰酶、多聚賴氨酸、單克隆抗體及免疫組化試劑盒（武漢博士德生物公司），超氧化物歧化酶測試盒（南京建成生物工程研究所）、丙二醛測試盒（南京建成生物工程研究所）、正常熔點瓊脂糖（西班牙Biowest公司）、低熔點瓊脂糖（德國Merck-Darmstadt公司）。熒光顯微鏡，DYY-32型電泳儀以及細胞培養(yǎng)相關(guān)材料。

1.3 視網(wǎng)膜毛細血管周細胞的原代培養(yǎng) 培養(yǎng)方法參照文獻[3]。分離胎牛眼視網(wǎng)膜，勻漿，0.2%膠原酶37℃消化40min，200目篩網(wǎng)過濾，離心，加入含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，接種入50cm培養(yǎng)瓶中，在37℃含5%CO2及90%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)，再去除培養(yǎng)液，烤干后采用鼠抗α平滑肌肌動蛋白抗體及兔抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體，進行視網(wǎng)膜血管周細胞免疫組化鑒定。

1.4 分組培養(yǎng) 取體外培養(yǎng)3代融合的周細胞，用培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。細胞貼壁后更換不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)液。對照組加入含20%胎牛血清的DMEM（5.5mmol/L）；模型組加入葡萄糖培養(yǎng)液（25mmol/L）；黃芪總黃酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組先加入葡萄糖培養(yǎng)液（25mmol/L），再分別加入 0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL 的黃芪總黃酮孵育6d。

1.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量檢測SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶法；MDA測定采用硫代巴比妥酸比色法。取周細胞培養(yǎng)上清50μL，按照試劑盒說明進行，使用722可見分光光度計測定吸光度，SOD活力及MDA含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析及直線相關(guān)回歸分析方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的BRPs 1～2d后貼壁，貼壁后逐漸伸展，呈不規(guī)則多角形，胞體不大，可見突起，生長較快，1～2周BRPs可達到融合，細胞密集，無接觸性抑制。α平滑肌肌動蛋白抗體染色顯示BRPs胞漿內(nèi)呈特異性棕黃色著色，陽性率達99%以上，兔抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色BRPs胞漿不著色。

2.2 黃芪總黃酮對周細胞MDA及SOD的影響 與模型組相比，黃芪總黃酮各組周細胞MDA含量降低、SOD活力減弱（P＜0.01）；并隨著黃芪總黃酮質(zhì)量濃度的增加，MDA含量降低呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而SOD活力并無明顯的劑量依賴性。黃芪總黃酮各組MDA/SOD減小，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；并隨著黃芪總黃酮濃度的增加，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

視網(wǎng)膜組織是眼睛的多層感覺組織，富含多不飽和脂肪酸，它對ROS和脂質(zhì)過氧化物特別敏感.自由基活性增強和抗氧化能力降低是DR發(fā)生的重要機制。研究證實抗氧化劑的應(yīng)用不僅能抑制氧自由基誘導(dǎo)的細胞凋亡，而且能防止糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生[3]。

表1 各組MDA含量及SOD活性比較 （±s）

表1 各組MDA含量及SOD活性比較 （±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與黃芪總黃酮Ⅰ組比較，▲P＜0.01；與黃芪總黃酮Ⅱ組比較，#P＜0.01；與黃芪總黃酮Ⅲ組比較，○P＜0.01。

SOD（U/mL） MDA/SOD組 別對照組模型組MDA（nmol/L）2.17±0.27 7.42±1.11**10.43±1.01 0.21±0.02 21.92±1.06** 0.34±0.04*黃芪總黃酮Ⅰ組 7 7.11±0.71** 20.62±0.63** 0.33±0.44*黃芪總黃酮Ⅱ組 7 5.74±0.46**△△▲ 18.46±0.59**△△▲ 0.31±0.03*△黃芪總黃酮Ⅲ組 7 4.77±0.28**△△▲# 16.04±0.48**△△▲# 0.29±0.02*△黃芪總黃酮Ⅳ組n 7 7 7 3.01±0.16**△△▲#○13.36±0.26**△△▲#○ 0.22±0.01△▲

黃芪具有改善循環(huán)、降糖、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等多種功效，已有臨床研究證實以黃芪為主要成分的中藥顆粒對保護周細胞、防止周細胞消失及基底膜增厚有較好療效。黃芪總黃酮是黃芪有效部分提取物，實驗表明其可降低細胞脂質(zhì)過氧化物的生成，直接清除羥自由基和超氧陰離子自由基，提高SOD細胞活性，對自由基所致細胞膜、蛋白質(zhì)以及DNA損傷有明顯的保護作用。而最近研究發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮具有抗突變、抗腫瘤和抑制動脈粥樣硬化等多種生物學(xué)效應(yīng)[4]。

本研究用其進行體外細胞試驗，觀察了黃芪總黃酮對體外培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜微血管周細胞氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果顯示一定質(zhì)量濃度的黃芪總黃酮對高糖培養(yǎng)下的牛視網(wǎng)膜微血管周細胞氧化應(yīng)激有明顯的抑制作用，且隨著黃芪總黃酮質(zhì)量濃度的增加，周細胞的氧化損傷降低。結(jié)果提示黃芪總黃酮對視網(wǎng)膜血管周細胞有一定保護作用，是一種很有前途的臨床抗氧化劑。（第一作者現(xiàn)在黑龍江省醫(yī)院工作）

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