范雪亮 肖金魚

解放軍第二五一醫(yī)院（河北張家口075000）

類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）是以四肢小關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為特征，伴有滑膜纖維母細胞增生，大量淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞浸潤的一種常見的自身免疫性疾病。目前RA的發(fā)病機制尚未完全闡明，但其典型的病理學(xué)特征為滑膜組織異常增生，其中細胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)持續(xù)作用于病變部位是導(dǎo)致病變侵蝕進展的主要原因之一。細胞因子通過介導(dǎo)細胞與細胞之間的相互作用引起組織損傷酶的釋放，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷，是RA炎癥和關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)。在諸多參與RA炎癥反應(yīng)的細胞因子中白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-10（IL-10）是少有的抑制炎癥因子，在RA類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中受到抑制[1]。本實驗酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)檢測佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠模型血清中IL-4和IL-10，以探討其在動物模型中的表達特點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 20只wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（150±30）g，合格證號：0172808，購于河北北方學(xué)院動物室；飼養(yǎng)于SPF動物實驗室，全年溫度21～24℃，相對濕度40%～67%。

1.2 試劑與儀器 弗氏完全佐劑購于美國Sigma公司；大鼠IL-4和IL-10 ELISA試劑盒均為美國Headquarters公司產(chǎn)品。TDL80-2B離心機，EL301strip reader酶標儀購于自美國Bio Tek公司。756MC型紫外可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 分組與造模 30只wistar大鼠隨機分成對照組（10只）、模型組（20只）。造模根據(jù)文獻[3]方法加以改進，正常條件飼養(yǎng)10d后，將弗氏完全佐劑搖勻后，按0.1mL/只注于模型組大鼠右后肢足跖內(nèi)造模。

1.4 病理組織學(xué)檢查 造模30d后取模型組5只大鼠的踝關(guān)節(jié)，經(jīng)固定、脫鈣石蠟包埋、切片后行蘇木精-伊紅（HE）染色。光鏡下觀察局部組織病理學(xué)變化。

1.5 影像學(xué)檢查 造模20d后取5只大鼠（用苦味酸做標記），每只大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg麻醉，行大鼠四肢關(guān)節(jié)X線攝片，觀察關(guān)節(jié)破壞情況。30d后在取相同大鼠重復(fù)操作，觀察關(guān)節(jié)破環(huán)情況。

1.6 模型評價 大鼠生長情況：普通實驗天平稱體質(zhì)量，造模前稱1次，造模后每兩日測量1次，記錄動物生長情況。同時仔細觀察動物的毛色、精神狀態(tài)及關(guān)節(jié)癥狀的變化。大鼠關(guān)節(jié)足腫脹：注射弗氏完全佐劑后，用容積法排水法測量雙后肢的足腫脹度。造模前觀察1次，后每周觀察1次，觀察足爪腫脹情況。同時對其他3只足爪炎癥進行評分。采用4分制的評分標準，每只大鼠的最高分為16分，記錄并比較20d時，對照組和造模組關(guān)節(jié)炎指數(shù)和雙后肢足腫脹度平均值差異。IL-4、IL-10含量：用10%水合氯醛（3.5mL/kg）麻醉大鼠，開胸使心臟暴露，進行心臟取血，全血2500r/min離心20min，取血清-20℃保存?zhèn)溆?。檢測IL-4、IL-10，具體操作按ELISA試劑盒說明進行。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 模型組大鼠體質(zhì)量明顯減輕，關(guān)節(jié)紅、腫，以對稱性后肢關(guān)節(jié)為主，累及踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、趾間關(guān)節(jié)等。20d左右出現(xiàn)第1個炎癥高峰，然后紅腫有一定程度消退；30d左右達到第2個高峰，進入慢性期，紅腫逐漸消退逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)強直、畸形以至功能障礙，表明慢性、對稱性、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生。

2.2 大鼠模型雙后肢足腫脹度 見表1。實驗第14日，大鼠關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)腫脹，而后足首先出現(xiàn)紅腫，后逐漸延伸至前足并日趨嚴重，20d腫脹達到最高值后逐漸減輕，模型組與對照組大鼠比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組組大鼠雙后肢足腫脹度比較 （±s）

表1 兩組組大鼠雙后肢足腫脹度比較 （±s）

與對照組比較，*P＜0.05。 下同。

組 別 n 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 關(guān)節(jié)體積（cm3）對照組 10 0.90±0.73 7.15±0.23模型組 10 7.29±1.82* 13.81±1.63*

2.3 大鼠模型雙后肢X線表現(xiàn) X線片顯示模型組大鼠以雙后肢改變?yōu)橹鳎?0d時隱約可見骨質(zhì)疏松，關(guān)節(jié)間隙模糊，30d時X線片可見明確的關(guān)節(jié)間隙模糊、變窄。 而對照組大鼠雙踝關(guān)節(jié)同時點比較，變化不大，無明顯骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)間隙清晰、未見骨質(zhì)破壞。

2.4 大鼠模型炎性足爪組織病理學(xué)改變 造模30d后，模型組大鼠節(jié)腔滑膜層次增多可達6～8層，甚至10余層，且排列不規(guī)整，滑膜內(nèi)有大量炎性細胞浸潤，以單核細胞和淋巴細胞為主，且在關(guān)節(jié)軟骨附近有血管翳形成，引起關(guān)節(jié)軟骨和骨組織破壞。

2.5 大鼠模型外周血IL-4和IL-10的表達 見表2。模型組IL-4和IL-10水平較對照組均明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 兩組大鼠炎性細胞因子水平比較 （ng/L，±s）

表2 兩組大鼠炎性細胞因子水平比較 （ng/L，±s）

組別 n IL-4 IL-10對照組 10 124.82±16.77 59.00±16.85*模型組 10 67.00±8.55* 29.11±27.59*

3 討 論

IL-4能調(diào)節(jié)多種不同類型細胞的活性，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子的活性，控制炎癥反應(yīng)。IL-4通過提高mRNA的降解率來抑制促炎性細胞因子的合成；IL-4還有保護軟骨和關(guān)節(jié)下骨及其他關(guān)節(jié)組織完整性的作用，主要通過減輕由INF、IL-1和LPS造成的蛋白多糖的破壞而起作用[2]。另外，IL-4能上調(diào)IL-1Ra的產(chǎn)生，刺激單核細胞/巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生可溶性Ⅱ型IL-1R、可溶性 TNF；同時IL-4可減少單核細胞MHC分子和共刺激分子的表達、NO的合成、PGE2的產(chǎn)生。IL-4能使Th1/Th2型細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和引導(dǎo)B細胞產(chǎn)生IgG1、IgG4、IgE 抗體，還可協(xié)同 IL-10 抑制 Th1 細胞反應(yīng)[5]。 這些現(xiàn)象表明，IL-4在RA的發(fā)病過程中通過抑制細胞反應(yīng)和抑制促炎性細胞因子而起抗炎作用。IL-10通過抑制核因子κB進而抑制 Th1細胞產(chǎn)生 TNF-α、IL-2、IFN-γ；IL-10可降低單核細胞HLA-DR抗原和 B7等協(xié)同刺激分子的表達，抑制Th1細胞介導(dǎo)的淋巴細胞活性；抑制NO合成和PGE2產(chǎn)生[6]。在正常情況下，炎癥因子和抗炎因子處于一個平衡狀態(tài)，如有外界原因使抗炎因子的分泌減少，打破這種平衡，則會引發(fā)類風濕關(guān)節(jié)炎，所以一些能夠促進抗炎因子分泌的藥物也成了研究熱點。本實驗通過對大鼠AA模型的制備及對對照組和模型組大鼠關(guān)節(jié)炎癥積分、影像學(xué)、病理學(xué)等相關(guān)指標的評估，進一步探討了IL-4和IL-10在AA模型中的表達特點。結(jié)果表明IL-4和IL-10大鼠模型中的表達受到了抑制，這與其在RA患者中的相關(guān)表達特點相類似。作為在RA中大量存在的T細胞來源的細胞因子IL-4和IL-10可能成為評價RA病情和治療療效的兩個最重要免疫學(xué)指標?？傊?，對IL-4和IL-10的深入研究必將有助于對RA發(fā)生機制的進一步認識，合理地評價RA的病情進展，為RA治療，包括藥物及免疫治療提供更加科學(xué)的實驗依據(jù)。

[1]劉慧招，沈敬華.類風濕關(guān)節(jié)炎免疫機制的研究進展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2008，40（3）：327-329.

[2]Wirjatijasa F，Dehghani F，Blaheta R A，et al.Interleukin-4，interleukin-10，and interleukin-1-receptor antagonist but not transforming growth factor-beta induce ramification and reduce adhesionmoleculeexpressionof ratmicroglialcells[J].JNeurosciRes，2002，68（5）：579-587.

[3]Vanroom JAG，Lafeber FP JG，Bijlsma JW J.synergistic activety of interleukin-4 and interleukin-10 in suppression of inflammation and joint destruction in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2001，44（10）：3-12.

[4]Fermandes JC，Martel-pelletier J，Pelletier JP.The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology [J].Biorheology，2002，39（12）：237-246.