徐紅日 王成祥 沈杏生 劉清泉 姜良鐸 王惠芳

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)防治流行性感冒(簡稱流感)的主要手段為疫苗和抗病毒藥物，但流感病毒抗原變異頻繁且抗病毒藥物出現(xiàn)耐藥性，因此流感的防治非常棘手[1]。中醫(yī)藥是中國防治流感的重要手段，歷年來中醫(yī)藥在防治流感的工作中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。以往中醫(yī)藥防治流感的實(shí)驗(yàn)研究多重視中藥的直接抗病毒作用。近年來中藥調(diào)節(jié)流感病毒感染機(jī)體免疫功能方面的研究逐漸增多。而有關(guān)中藥抗流感病毒感染所致機(jī)體免疫損傷及修復(fù)其病理損傷方面的報(bào)道較少。近年來的研究證實(shí)[2]，流感病毒引起的靶器官的損傷，主要是由免疫細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)所介導(dǎo)的一種炎癥病理損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)態(tài)觀察清熱解毒中藥對(duì)FM1株感染所致小鼠肺部炎癥損傷的影響，探討其治療流感的藥效學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物

清熱解毒中藥(由生石膏30 g、黃芩10 g、生甘草3 g共3味藥組成，為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院治療流感的效方益氣清瘟解毒合劑中所含的清熱解毒藥物)為江蘇天江藥業(yè)有限公司提供的配方免煎顆粒劑，用去離子水配成混懸液。

1.2 實(shí)驗(yàn)病毒株

采用流感病毒亞洲甲型鼠肺適應(yīng)株(FM1株)，由中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)病毒研究所流感室提供，用雞胚傳代至血凝滴度為1∶1280，-70℃凍存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用BALB/cAnN小鼠，清潔級(jí)，雄性，體重18～23 g，共96只，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所，合格證號(hào)SCXK(京)2004-0001。

1.4 儀器設(shè)備

光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS IX71，奧林巴斯光學(xué)有限公司)、透射電鏡(JEM-1230，日本電子株式會(huì)社)等。

1.5 實(shí)驗(yàn)操作方法

將小鼠隨機(jī)分為3組，分別為空白對(duì)照組、病毒感染模型組和中藥治療組，各組按病毒感染后第1、3、5、7天不同時(shí)相各分為4個(gè)小組，每小組8只小鼠。用乙醚輕度麻醉小鼠后，空白對(duì)照組以生理鹽水滴鼻，每只滴25 μl。其余兩組以25 μl FM1株病毒液滴鼻，感染量為1 LD50。

用FM1株感染小鼠0.5小時(shí)后灌胃。中藥治療組灌服清熱解毒中藥混懸液，相當(dāng)于成人臨床劑量，即5.58 g·kg-1·d-1。每次給藥前均稱實(shí)驗(yàn)小鼠的體重，根據(jù)小鼠體重確定給藥量?？瞻讓?duì)照組與病毒感染模型組灌等量生理鹽水，每日灌胃1次。

小鼠感染流感病毒FM1株后第1、3、5、7天，摘眼球放血處死動(dòng)物，打開胸腔摘出全肺，肉眼觀察記錄肺部大體病變情況。

制作各組小鼠蘇木素—伊紅染色(HE染色)病理切片，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)比觀察各組動(dòng)物肺組織病變的情況。

取全部3組小鼠的肺組織制作醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色超薄病理切片，透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察

肉眼觀察各時(shí)間段空白對(duì)照組小鼠，其肺臟表面光滑，呈現(xiàn)淡粉紅色，未見充血、水腫及梗死灶，無出血及含氣，未發(fā)現(xiàn)肺實(shí)變。病毒感染模型組小鼠在FM1株感染后各時(shí)相，其肺臟大多數(shù)均有兩個(gè)肺葉以上成片的明顯實(shí)變區(qū)，肺臟水腫嚴(yán)重，表面有散在斑片狀出血，外觀呈現(xiàn)暗紅色，尤其在FM1株感染后第3～5天，肺臟實(shí)變程度最為嚴(yán)重。中藥治療組小鼠肺臟病變程度在FM1株感染不同時(shí)相較病毒感染模型組均明顯減輕，特別是在流感病毒FM1株感染后3～5天，能顯著減輕肺部的病變，肺臟表面僅有少量紅色滲出液，肺臟外觀呈現(xiàn)紅色，肺實(shí)變區(qū)顯著減少。

2.2 光鏡觀察

光鏡下觀察空白對(duì)照組小鼠支氣管結(jié)構(gòu)無損傷，肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔形態(tài)均完整，細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。見圖1。

病毒感染模型組小鼠肺組織可見單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞大量浸潤，表現(xiàn)為肺組織間質(zhì)性炎癥，病變數(shù)量較多，且范圍廣泛，炎癥細(xì)胞分布密度很高；病變肺組織細(xì)支氣管黏膜上皮明顯脫落，僅剩一層基底細(xì)胞，細(xì)支氣管腔內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出；病變肺組織小血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹；肺泡壁廣泛淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤，肺泡壁顯著增厚，結(jié)構(gòu)破壞不清；肺組織病灶周圍或其他無病變肺組織呈現(xiàn)明顯的代償性肺氣腫。這種炎癥病理損傷在流感病毒FM1株感染后3～5天最為嚴(yán)重。見圖2～5。

清熱解毒中藥治療組小鼠肺臟病變范圍較病毒感染模型組明顯減少，病變程度亦明顯減輕，尤其在感染后3～7天，肺臟病變較病毒感染模型組顯著減輕。其病變表現(xiàn)為肺組織病灶較小，病變數(shù)量較少，炎癥細(xì)胞分布密度較低；細(xì)支氣管上皮脫落明顯減輕，細(xì)支氣管腔內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出顯著減少，小血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹亦明顯減輕；肺泡腔內(nèi)只見少許漿液性滲出，肺泡壁少量單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡壁間隔較薄。見圖6～9。

2.3 電鏡觀察

空白對(duì)照組小鼠肺臟在FM1株感染后各時(shí)相，其肺組織病理學(xué)無明顯異常。其支氣管纖毛上皮細(xì)胞核輕微增大，肺泡內(nèi)有微量充血，毛細(xì)血管個(gè)別內(nèi)皮細(xì)胞增大。見圖10～11。

病毒感染模型組小鼠肺組織可見支氣管上皮細(xì)胞明顯腫脹，表面微絨毛脫落，細(xì)胞漿疏松，只有部分纖毛保留；其肺泡上皮細(xì)胞明顯腫脹，且表面破裂，微絨毛脫落，細(xì)胞質(zhì)疏松；其毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞亦顯著腫脹，明顯突向管腔。見圖12～16。

清熱解毒中藥治療組小鼠肺組織病變較病毒感染模型組明顯減輕，其肺泡壁較薄，肺泡上皮細(xì)胞大致正常，可見Ⅱ型細(xì)胞增生；其毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)大致正常，無腫脹。清熱解毒中藥的這種作用在FM1株感染后3～5天最為突出。見圖17～18。

3 討論

流感病毒主要侵入機(jī)體呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，在上皮細(xì)胞內(nèi)繁殖，損害柱狀纖毛上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞，腺體的分泌功能受到損傷，并有上皮細(xì)胞增生、壞死、黏膜局部充血、水腫和淺表潰瘍等卡他性病變。進(jìn)而基底病變可擴(kuò)展到支氣管、細(xì)支氣管、肺泡和支氣管周圍組織，引起黏膜水腫、充血、淋巴細(xì)胞浸潤，使細(xì)胞出現(xiàn)空泡、皺縮、纖毛丟失、細(xì)胞核圓縮和破碎、壞死脫落、并伴有微血管栓塞、出血等[2-4]。流感病毒FM1株感染小鼠后，引起呼吸器官的損傷，導(dǎo)致病毒性肺炎的發(fā)生。流感病毒以及流感病毒感染機(jī)體后所產(chǎn)生的各種炎性介質(zhì)參與了炎癥反應(yīng)，且已明確細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中起到重要的作用[5]。細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素1(IL-1)等是公認(rèn)的促炎性細(xì)胞因子。這些炎性細(xì)胞因子的過度釋放可導(dǎo)致機(jī)體的免疫炎癥損傷。而白介素10(IL-10)為抗炎性細(xì)胞因子，可抑制上述促炎性細(xì)胞因子的過度釋放，調(diào)節(jié)失控的炎癥反應(yīng)。

本研究中，病毒感染模型組在FM1株感染后3～5天，其肺部的病變最為嚴(yán)重。結(jié)合前期的研究[6]，此時(shí)小鼠體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1的釋放急劇增多，達(dá)到峰值。此時(shí)體內(nèi)炎癥反應(yīng)最為激烈，產(chǎn)生炎癥“瀑布”反應(yīng)，導(dǎo)致靶器官的嚴(yán)重?fù)p傷。炎癥反應(yīng)最激烈的時(shí)期為急性熱病熱毒亢盛的極期。此時(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了生理濃度的促炎性細(xì)胞因子成為體內(nèi)的“毒邪”，氣分毒盛，累及營血，氣血逆亂，直損臟器。

圖1 空白對(duì)照組小鼠肺病理切片

(肺泡壁薄，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無炎性分泌物，肺泡間質(zhì)亦無炎癥細(xì)胞浸潤。)(HE染色，×400)

圖2 病毒感染模型組感染后第1天小鼠肺病理切片

(病毒感染第1天，肺泡間隔增厚，肺泡壁和細(xì)支氣管壁有較多單個(gè)核細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有漿液性滲出，細(xì)支氣管腔尚未見炎性滲出。)(HE染色，×400)

圖3 病毒感染模型組感染后第3天小鼠肺病理切片

(病毒感染后第3天病變最重，肺泡間隔重度增厚，顯示出重度間質(zhì)性肺炎的病變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞增多，細(xì)支氣管上皮脫落，細(xì)支氣管腔內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤。)(HE染色，×400)

圖4 病毒感染模型組感染后第5天小鼠肺病理切片

(病毒感染后第5天病變?nèi)灾?，肺泡間隔明顯增厚，顯示出重度間質(zhì)性肺炎的病變，細(xì)支氣管壁增厚，有大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管腔內(nèi)有較多炎性滲出。)(HE染色，×400)

圖5 病毒感染模型組感染后第7天小鼠肺病理切片

(病毒感染第7天，病變較前略有減輕，肺泡壁仍有較多單個(gè)核細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚明顯，顯示出較重的間質(zhì)性肺炎病變，肺泡壁破壞，肺泡腔內(nèi)仍有漿液性滲出。)(HE染色，×400)

圖6 中藥治療組感染后第1天小鼠肺病理切片

(中藥治療組感染后第1天，肺泡腔內(nèi)少許漿液性滲出，肺泡壁少量單個(gè)核細(xì)胞浸潤，肺泡壁較薄，間質(zhì)輕度炎性病變。)(HE染色，×400)

圖7 中藥治療組感染后第3天小鼠肺病理切片

(中藥治療組，感染后第3天，肺泡壁較薄，炎性細(xì)胞浸潤較少，腔內(nèi)有少量漿液性滲出，肺泡間隔輕度增厚。)(HE染色，×400)

圖8 中藥治療組感染后第5天小鼠肺病理切片

(中藥治療組，感染后第5天，病變較前減輕，顯示肺泡壁輕度增厚，有少量單個(gè)核細(xì)胞浸潤，肺泡間隔輕度增厚。)(HE染色，×400)

圖9 中藥治療組感染后第7天小鼠肺病理切片

(中藥治療組，感染后第7天，肺泡壁較薄，單個(gè)核細(xì)胞浸潤較少，毛細(xì)血管內(nèi)炎癥細(xì)胞較少，肺泡間隔增厚不明顯。)(HE染色，×400)

圖10 空白對(duì)照組小鼠肺泡透視電鏡切片

(肺泡上皮細(xì)胞無增生，肺泡壁無增厚，有微量充血。)(Bar=2μ, ×10000)

圖11 空白對(duì)照組小鼠肺內(nèi)血管透視電鏡切片

(血管，毛細(xì)血管較薄，個(gè)別內(nèi)皮細(xì)胞增大)(Bar=10μ, ×2500)

圖12 病毒感染模型組感染后第1天小鼠肺支氣管透射電鏡切片

(支氣管及其上皮細(xì)胞明顯腫脹，其表面微絨毛脫落，細(xì)胞漿疏松。)(Bar=2μ, ×4000)

圖13 病毒感染模型組感染后第1天小鼠肺泡結(jié)構(gòu)透視電鏡切片

(肺泡上皮細(xì)胞表面破裂，微絨毛脫落。)(Bar=10μ, ×6000)

圖14 病毒感染模型組感染后第1天小鼠肺內(nèi)血管透射電鏡切片

(病變肺組織血管、毛細(xì)血管明顯腫脹，突向管腔)(Bar=2μ, ×5000)

圖15 病毒感染模型組感染后第7天小鼠肺泡結(jié)構(gòu)透視電鏡切片

(肺泡及肺泡上皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)疏松。)(Bar=2μ, ×5000)

圖16 病毒感染模型組感染后第7天小鼠肺內(nèi)血管透視電鏡切片

(血管、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，明顯突向管腔。)(Bar=2μ, ×6000)

圖17 中藥治療組感染后第1天小鼠肺透視電鏡切片

(肺泡壁薄，上皮細(xì)胞形態(tài)大致正常，Ⅱ型細(xì)胞增生。)(Bar=2μ, ×4000)

圖18 中藥治療組感染后第5天小鼠肺透視電鏡切片

(病變組織血管及血管內(nèi)皮形態(tài)基本正常，無明顯腫脹。)(Bar=2μ, ×8000)

李玲等[7]研究報(bào)道，麻杏石甘湯能顯著降低A型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)，并通過調(diào)節(jié)肺中細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子β(TNF-β)的蛋白表達(dá)水平對(duì)小鼠起到保護(hù)作用。研究表明[8,9]，含有黃芩等清熱解毒中藥的復(fù)方注射液，通過調(diào)節(jié)肺中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，明顯減輕流感病毒FM1株感染小鼠肺部的炎癥損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)[10]，甘草粗提物及甘草酸單銨鹽均能顯著抑制H9N2亞型流感病毒鼠肺適應(yīng)株引起的小鼠肺炎病變，延長小鼠生存期。提示具有清熱解毒功效的中藥及其復(fù)方，對(duì)流感病毒性肺炎病變具有一定的改善作用。近20年的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[11]，抗流感病毒的方藥大多為清熱解毒藥物，具有明顯的抑制流感病毒、抗炎和增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能等作用。

益氣清瘟解毒合劑為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院治療流感的效方，用治近年來北京地區(qū)流感取得了滿意的療效。在前期拆方的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)[6]，該方所含有的清熱解毒中藥能夠在FM1株感染后3～7天，明顯減少小鼠體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1的過度釋放，并在FM1株感染后各時(shí)相，增加抗炎性細(xì)胞因子IL-10的分泌，從而顯著抑制免疫炎癥反應(yīng)，其作用強(qiáng)于益氣清瘟解毒合劑所含其他治療法則。

本研究顯示，清熱解毒中藥治療組小鼠肺部病變范圍較小，炎癥細(xì)胞浸潤少，呼吸器官的病理損傷相對(duì)較輕。尤其在流感病毒感染所致炎癥病理損傷最嚴(yán)重的FM1株感染后3～5天，明顯改善小鼠肺組織的病理損傷。清熱解毒中藥治療組由生石膏、黃芩、生甘草等組成。其中，生石膏辛甘大寒，入肺胃，具有清熱瀉火的功效。《本草經(jīng)疏》中有“石膏，辛能解肌，甘能緩熱，大寒而兼辛甘能除大熱”的記載。故在此，石膏能透散熱毒，使郁閉于體內(nèi)的毒邪透達(dá)于外。黃芩苦寒，入肺胃肝膽，清熱瀉火解毒，專清已郁之熱毒。生甘草味甘，既可清熱解毒，又能益氣以利于扶正祛邪。三藥合用，將“清、透、解”溶為一體，清氣透邪解毒，使毒邪從上、從表而出，從而達(dá)到排除毒素、退熱并解除流感全身中毒癥狀的作用。清熱解毒中藥治療組小鼠的肺炎病變較輕，與針對(duì)熱病極期熱毒亢盛的病機(jī)，發(fā)揮其作用有關(guān)。結(jié)合前期益氣清瘟解毒合劑拆方的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[6]，其微觀化機(jī)制，可能與在FM1株感染的3～7天，上述清熱解毒中藥顯著減少促炎性細(xì)胞因子的過度釋放，增加抗炎性細(xì)胞因子的分泌，及時(shí)糾正失衡的炎癥反應(yīng)，即抑制機(jī)體過度亢進(jìn)的炎癥反應(yīng)，從而減輕炎癥病理損傷，促進(jìn)肺組織炎性病變的修復(fù)有關(guān)。

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