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        三株雞源H4亞型禽流感病毒分離株HA基因的序列分析

        2011-05-31 06:55:28蔣文明陳繼明

        張 鵬,黃 娟,陳 杰,蔣文明*,陳繼明,單 虎

        (1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東青島 266109;2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032)

        禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)屬于正黏病毒科A型流感病毒屬,亞型眾多,根據(jù)致病力的差異可分為高致病性AIV和低致病性AIV[1]。高致病性AI在國內(nèi)外頻頻暴發(fā),不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的損失,同時(shí)也威脅人類的健康,從而引起了人們的高度重視。低致病性AIV 雖對動(dòng)物多呈低致病性,但具有分布廣泛的特點(diǎn),能夠使產(chǎn)蛋量下降,造成宿主的免疫抑制以及可以與其他病原微生物發(fā)生協(xié)同作用,引起繼發(fā)感染,其危害也不容忽視[2]。

        H4亞型AIV是一種低致病性毒株,多從水禽和野鳥體內(nèi)分離到,在鴨、鵝和鳥等體內(nèi)持續(xù)存在,并且可能傳播給雞[2-3],雞感染后不引起明顯的臨床疾病或死亡,只能觀察到輕微病變或弱血清陽轉(zhuǎn),但是會(huì)持續(xù)排毒,這給雞群禽流感的控制帶來了困難[3]。H4亞型AIV感染后,可再次感染H5、H9或其他亞型AIV,在宿主體內(nèi)可能發(fā)生復(fù)雜的基因重組,產(chǎn)生新型的重組病毒。1999年,加拿大報(bào)道了從患有肺炎的豬體內(nèi)分離到H4N6亞型AIV[4],我國豬群也受到H4亞型AIV的威脅[5],表明該亞型病毒也可以在種間傳播。因此,有必要對H4亞型AIV加強(qiáng)監(jiān)測。

        國內(nèi)自20世紀(jì)80年代起雖不斷有分離到H4亞型AIV的報(bào)道,但是大多通過血清學(xué)進(jìn)行亞型鑒定的[6-8]。NCBI流感病毒數(shù)據(jù)庫收錄了來自中國內(nèi)地的H4亞型AIV 18株,其中,提交了血凝素(hemagglutinin,HA)全基因序列的僅有8株,即 A/mallard/PoyangLake/15/2007(H4N6)(FJ428583),A/mallard/Yanchen/2005(H4N6)(EU880342),A/duck/Nanchang/4165/2000(H4N6)(CY006017),A/duck/PoyangLake/FB13/2007 ( H4N6 )(FJ439566 ), A/mallard/PoyangLake/P17/2007(H4N6)(FJ439565),A/mallard/Zhalong/88/2004(H4N6)(FJ349247),A/duck/Hunan/819/2009(H4N2)(HQ285886),A/duck/Guangxi/912/2008(H4N2)(CY076892),這些毒株全部來源于鴨和野鴨,尚無雞源H4亞型AIV分離株的HA全基因序列。

        本研究對新分離的3株雞源H4亞型AIV進(jìn)行了HA基因的全序列測定及分析,為進(jìn)一步了解H4亞型AIV的來源和進(jìn)化特征,探討其分子演化規(guī)律提供線索。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 樣品 2010年10月份全國禽病流行病學(xué)調(diào)查中,自安徽省某雞場采集的雞口腔和泄殖腔拭子(由中國流行病學(xué)與動(dòng)物衛(wèi)生中心提供),拭子裝在含有抗生素的PBS甘油采樣液中。

        1.1.2 SPF雞胚 SPF雞胚購自北京梅里亞公司。

        1.1.3 主要試劑 RNAiso Plus和RNA病毒一步法PCR試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。DNA膠回收試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品。

        1.1.4 引物 根據(jù)A型流感病毒血凝素(HA)基因片段兩端的核苷酸保守序列,采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上 游 引 物 P1: 5 '-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG-3',下 游 引 物 P2:5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGT GTTTT-3',預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為1 750bp。

        1.2 方法

        1.2.1 病毒分離 將采集的拭子以10 000r/min離心5min,每個(gè)拭子取上清液經(jīng)尿囊腔接種兩枚9日齡SPF雞胚,37℃培養(yǎng),每24h觀察一次,收集24 h~72h自然死亡和未死亡雞胚尿囊液,置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 RNA提取 取300μL尿囊液到800μL RNAiso Plus中混勻,靜置5min;加入250μL氯仿,振蕩混勻,靜置5min;4℃、12 000r/min離心15 min;小心吸取上清540μL,加入等體積的異丙醇,混勻,-20℃靜置2h~3h,以沉淀 RNA;4℃、12 000 r/min離心10min,棄上清;加入1mL濃度為750 mL/L的乙醇洗滌1次;4℃、8 000r/min離心5 min;棄上清,干燥,用20μL DEPC水溶解RNA,置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 HA基因的擴(kuò)增、克隆與測序 按照RNA病毒一步法PCR試劑盒的說明書進(jìn)行操作,PCR條件為:50℃30min,94℃2min,94℃30s,57℃30s,72℃2min,30個(gè)循環(huán);72℃10min。DNA片段回收后與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化,經(jīng)氨芐平板篩選出陽性質(zhì)粒,鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

        1.2.4 序列分析和比較 用DNA Star軟件對測定的病毒HA基因全長序列進(jìn)行分析,并與GenBank中的中國分離株進(jìn)行比較。所用到的毒株有A/mallard/PoyangLake/15/2007(H4N6)(FJ428583),A/mallard/Yanchen/2005(H4N6)(EU880342),A/duck/Nanchang/4165/2000(H4N6)(CY006017),A/duck/PoyangLake/FB13/2007 ( H4N6 )(FJ439566 ), A/mallard/PoyangLake/P17/2007(H4N6)(FJ439565),A/mallard/Zhalong/88/2004(H4N6)(FJ349247),A/duck/Hunan/819/2009(H4N2)(HQ285886),A/duck/Guangxi/912/2008(H4N2)(CY076892)。

        1.2.5 國內(nèi)外H4亞型AIV分離株HA基因序列比較 根據(jù)已測得的HA基因序列,在NCBI的Influenza Virus Resource數(shù)據(jù)庫里,搜索所有其收錄H4亞型的基因序列,對于同一國家或地區(qū),同一年份或相似年份,同一H亞型隨機(jī)選取一株,共選取42株序列,應(yīng)用MEGA5軟件對所測得的序列和在NCBI數(shù)據(jù)里選定的序列進(jìn)行比較,構(gòu)建進(jìn)化樹。

        2 結(jié)果

        2.1 HA基因的RT-PCR擴(kuò)增與克隆測序

        從尿囊液提取的RNA模板中擴(kuò)增得到HA基因片段,10g/L的瓊脂糖凝膠電泳證明獲得了與預(yù)期1 750bp左右的片段大小相符的清晰的、單一條帶。將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體并測序,通過序列比對可鑒定為H4亞型禽流感病毒,毒株命 名 為 A/chicken/Anhui/AB22/2010、A/chicken/Anhui/AB29/2010, A/chicken/Anhui/AB30/2010。

        2.2 序列分析結(jié)果

        用DNA Star分析序列可得,A/chicken/Anhui/AB22/2010,A/chicken/Anhui/AB30/2010 和 A/chicken/Anhui/AB29/2010的 HA 基因編碼區(qū)均由1 738個(gè)核苷酸組成,有一個(gè)開放閱讀框(ORF),大小為1 605bp,編碼535個(gè)氨基酸。

        推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明,A/chicken/Anhui/AB22/2010和 A/chicken/Anhui/AB29/2010兩株毒株含有5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),其中4個(gè)位于HA1部分(15aa~17aa、31aa~33aa、175aa~177aa、307aa~309aa),1個(gè)位于 HA2部分(494aa~496aa)。A/chicken/Anhui/AB30/2010含有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),其中5個(gè)位于HA1部分(11aa~13aa、15aa~17aa、31aa~33aa、175aa~177aa、307aa~309aa),1個(gè)位于HA2部分(494aa~496aa)。3株毒株的裂解位點(diǎn)處氨基酸均為PEKASRG,均符合典型的低致病性AIV特征(表1)。

        2.3 3個(gè)分離株與國內(nèi)毒株HA基因序列比較

        通過MEGA軟件運(yùn)算可得A/chicken/Anhui/AB22/2010,A/chicken/Anhui/AB29/2010 和 A/chicken/Anhui/AB30/2010 3株分離株之間的同源性在99%以上,與國內(nèi)報(bào)道毒株的同源性在80%到90%之間,但與來自湖南的毒株 A/duck/Hunan/819/2009(H4N2)遺傳距離在0.02以下,即同源性在98%以上(表2)。

        表1 HA基因幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的分析Table 1 Amino acids in the key sites of the HA gene of 3isolates

        表2 分離株與國內(nèi)報(bào)道毒株的遺傳距離Table 2 Genetic distance of isolates and domestic reported strains

        2.4 國內(nèi)外H4亞型AIV分離株HA基因序列比較

        用MEGA5軟件繪制出的進(jìn)化樹(圖1),從進(jìn)化樹上看,全球H4亞型存在著差異較大的兩個(gè)譜系,即西半球譜系(h4.1譜系)和東半球譜系(h4.2譜系),并且這兩個(gè)較大的分支演變出了很多個(gè)亞分支。中國內(nèi)地分離株分別處于h4.2.3(亞洲)分支和h4.2.6分支(歐亞)上,3個(gè)分離株與湖南的毒株A/duck/Hunan/819/2009(H4N2)同處于東半球譜系的歐亞分支上。

        圖1 全球H4亞型禽流感病毒進(jìn)化分析(箭頭所指為分離株)Fig.1 Phylogenetic analysis of global H4AIV(the arrows indicate isolates)

        3 討論

        HA是AIV表面的一種糖蛋白,是AIV亞型或新變種的主要標(biāo)志,其裂解位點(diǎn)的序列直接影響毒株致病力的高低[9]。因此,研究HA基因有助于了解AIV的特征和來源,從而進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析、評估和疾病預(yù)報(bào)預(yù)警。HA上裂解位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)的突變則有可能導(dǎo)致病毒毒力發(fā)生根本性的變化。所有高致病力病毒在這一區(qū)域都含有多個(gè)堿性氨基酸序列[10],而低致病力毒株這一區(qū)域常含有一個(gè)精氨酸,在本研究中,3個(gè)H4亞型分離株裂解位點(diǎn)處氨基酸序列為PEKASR,僅含有1個(gè)精氨酸,為低致病性AIV的特征序列。3個(gè)分離株與A/duck/Hunan/819/2009(H4N2)親緣關(guān)系很近,同源率可達(dá)98.4%以上,說明這些病毒可能由同一祖先演化而來。發(fā)生在HA受體結(jié)合位點(diǎn)上的突變有時(shí)可能改變病毒的宿主特異性,Allen C等[11]報(bào)道,H4亞型AIV 226位氨基酸由Gln(Q)突變?yōu)長eu(L),可提高對2,6-linkage唾液酸受體的結(jié)合活性,從而增加感染豬或人的風(fēng)險(xiǎn),對所分離的3株H4亞型AIV此位點(diǎn)的分析表明,均為Asn(N),這種突變是否會(huì)影響病毒的毒力和宿主特性,當(dāng)該病毒感染雞是否會(huì)造成流行,仍需進(jìn)一步的研究。

        在遺傳演化上,AIV的多數(shù)基因一般都可分為兩個(gè)譜系,即東半球譜系和西半球譜系[12-13]。我們的分析結(jié)果顯示,全球H4亞型的HIV確實(shí)存在著兩個(gè)差別較大的譜系,西半球譜系和東半球譜系。我國國內(nèi)分離株分別處于東半球譜系h4.2.3(亞洲)分支和h4.2.6分支(歐亞)上,其中,3株分離株處于東半球譜系的歐亞分支上,且與A/duck/Hunan/819/2009處于同一分支。東半球譜系相對于西半球譜系來說分支較為復(fù)雜,組間的同源性也比較低。H4亞型AIV多分離自水禽和野鳥,野生水禽(特別是野鴨)可將病毒傳給家養(yǎng)水禽,家養(yǎng)水禽再將病毒傳給陸生家禽,使病毒在陸生家禽之間傳播,而且病毒還可回傳給家養(yǎng)水禽,豐富了家養(yǎng)水禽的基因庫,增加了病毒發(fā)生基因重組的機(jī)會(huì)[14],因此應(yīng)加強(qiáng)對家養(yǎng)水禽(尤其是家鴨)的監(jiān)測。

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