李俊行，祖金祥，劉樹民，柳長鳳，黃志桓，董婉茹（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱市 150040）

黃連解毒湯出自《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子4味中藥組方而成，為瀉火解毒的基礎(chǔ)方劑，主治三焦火毒證，有諸多藥理作用[1，2]，現(xiàn)代常用于治療敗血癥、膿毒血癥、痢疾、肺炎等證屬火毒熾盛者[3]。其化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜，主要包括環(huán)烯醚萜類、生物堿類和黃酮類等活性成分[4，5]。本研究選取黃連解毒湯中含量較高的4種代表性成分為綜合指標(biāo)，建立同時測定方中梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和黃芩苷含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）方法，用以全面控制黃連解毒湯的內(nèi)在質(zhì)量；并進一步研究配伍對黃連解毒湯中4種成分含量的影響，分析各藥味之間的相互作用，為該方配伍規(guī)律的研究提供一定參考。

1 儀器與試藥

2695型HPLC儀，包括四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；Empower色譜工作站（美國Waters公司）；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300 W，頻率：80 kHz）；METTLER-TOLEDO AG135型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；DZF-6030B型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

所選黃連、黃柏產(chǎn)自四川，黃芩產(chǎn)自黑龍江，梔子產(chǎn)自江西，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院王連芝副研究員鑒定分別為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖、蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.除去粗皮的干燥樹皮、唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根、茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實；梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110749-200613、110713-200609、110732-200506、110715-200815）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

各藥材經(jīng)適當(dāng)粉碎后，過篩，按處方比例稱取600 g（黃連180 g、黃芩120 g、黃柏120 g、梔子180 g），加入8倍量水，浸泡2 h，加熱回流提取1.5 h，過濾，濾渣加入6倍量水，再回流提取1.5 h，過濾，合并煎煮液，濃縮至適當(dāng)濃度后移至托盤中，最后置于真空干燥箱中干燥至恒重，粉碎，得棕褐色粉末，備用；按同樣方法得到各單味藥水提物粉末。

2.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：260 nm；流動相：乙腈（A）-0.1%冰乙酸，梯度洗脫（0～15 min，11%A；15～20 min，11%～16%A；20～35 min，16%A；35～38 min，16%～28%A；38～48 min，維持28%A）；進樣量：10 μL。

2.3 檢測波長的選擇

本試驗采用二極管陣列檢測器，在分析時采用全波長掃描，在不同波長下提取色譜圖。經(jīng)比較分析表明，260 nm波長處提取的色譜圖能同時檢出4種成分且響應(yīng)值較高，可以保證對4種成分均有較好的靈敏度，故選擇260 nm為檢測波長。

2.4 混合對照品貯備液的制備

分別精密稱取各對照品適量，用甲醇超聲溶解，制成每1 mL含梔子苷125 μg、鹽酸小檗堿50 μg、鹽酸巴馬汀37.5 μg、黃芩苷45 μg的混合對照品貯備液，保存于4℃冰箱中，備用。

2.5 供試品溶液的制備

取全方及各單煎方水提物細(xì)粉適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和線性關(guān)系的考察

分別精密量取混合對照品貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件分別進樣10 μL，記錄各色譜圖。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進樣量（X）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得4種成分的回歸方程（見表1）。結(jié)果表明，梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和黃芩苷在各自進樣量范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

表1 各成分的線性關(guān)系表Tab 1 Results of linear correlation of each constituent

2.7 精密度試驗

取混合對照品貯備液適量，在上述色譜條件下連續(xù)進樣5次，測定峰面積。結(jié)果，梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.94%、1.38%、1.69%和2.33%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液適量，室溫下保存，分別于0、3、6、12、24 h測定峰面積。結(jié)果，梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷峰面積的RSD分別為2.29%、2.23%、1.54%和2.49%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一批樣品適量，按“2.5”項下方法平行制備6份供試品溶液，測定峰面積。結(jié)果，梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.94%、1.76%、1.14%和2.30%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.10 選擇性試驗

按處方組成和比例，照復(fù)方樣品與“2.5”項下方法分別制成缺梔子，缺黃連、黃柏與缺黃芩的陰性對照溶液，依法進樣。結(jié)果，相應(yīng)陰性對照溶液色譜在梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和黃芩苷色譜峰處無吸收峰，表明在該試驗條件下制劑中其他成分對測定結(jié)果均無干擾，該方法選擇性較好。色譜見圖1。

圖1 黃連解毒湯供試品溶液、混合對照品溶液與陰性對照溶液的HPLC圖A.供試品；B.混合對照品；C.缺梔子的陰性對照；D.缺黃連、黃柏的陰性對照；E.缺黃芩的陰性對照；1.梔子苷；2.鹽酸小檗堿；3.鹽酸巴馬?。?.黃芩苷Fig 1 HPLC chromatograms of HLJDD，mixed control and negative controlA.test sample；B.mixed control；C.negative control without Gardenia jasminoides；D.negative control without Coptis chinensis and Phellodendron chinensis；E.negative control without Scutellaria baicalensis；1.jasminoidin；2.berberine hydrochloride；3.palmatine hydrochloride；4 baicalin

2.11 加樣回收率試驗

取已知含量的黃連解毒湯水提物細(xì)粉適量，共6份，精密稱定，分別精密加入混合對照品貯備液1.5 mL，按“2.5”項下方法制備供試品溶液，并按上述方法測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of samples（n＝6）

2.12 樣品含量測定

2.12.1 黃連解毒湯水提物中4種成分的含量測定 取黃連解毒湯水提物樣品適量，按“2.5”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，以隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。結(jié)果，黃連解毒湯水提物樣品中梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和黃芩苷的含量分別為（24.59±0.19）、（14.24±0.26）、（5.97±0.11）、（7.30±0.18）mg·g-1。

2.12.2 全方及各單煎方水提物中4種成分的含量測定 取各樣品，分別按“2.5”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定（色譜見圖2），以隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量，并折算成一個處方中藥材（黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g）所含的化合物的質(zhì)量，結(jié)果見表3。

圖2 黃連解毒湯全方水提物、混合對照品溶液與單煎方水提物的HPLC圖A.全方水提物；B.混合對照品；C.黃連水提物；D.黃芩水提物；E.黃柏水提物；F.梔子水提物；1.梔子苷；2.鹽酸小檗堿；3.鹽酸巴馬??；4.黃芩苷Fig 2 HPLC chromatograms of aqueous extract of HLJDD，mixed control and aqueous extract of single component decoctionA.aqueous extract of HLJDD；B.mixed control；C.aqueous extract of C.chinensis；D.aqueous extract of S.baicalensis；E.aqueous extract of P.chinensis；F.aqueous extract of G.jasminoides；1.jasminoidin；2.berberine hydrochloride；3.palmatine hydrochloride；4.baicalin

表3 全方與各單煎方水提物含量測定結(jié)果Tab 3 Results of content determination of HLJDD and single component decoction

3 討論

通過比較全方與各單煎方水提物中4種成分的含量變化可知，上述成分的含量在4味藥共煎時比單味藥煎煮時要低，與文獻報道相一致[6]。鹽酸小檗堿與鹽酸巴馬汀是黃連解毒湯中生物堿類的代表成分，黃芩苷是黃酮類的代表成分，梔子苷是環(huán)烯醚萜類的代表成分，在煎煮的過程中，生物堿類物質(zhì)容易與黃酮類、環(huán)烯醚萜類酸性物質(zhì)產(chǎn)生共沉淀而含量降低。但在藥效學(xué)實驗研究中發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯全方作用明顯大于4味單藥作用[7，8]，可能是由于中藥或其復(fù)方這一復(fù)雜體系含有眾多化學(xué)成分，但只有這些成分的相對含量達到特定比例時才有利于藥效的最大發(fā)揮，缺少某些重要的成分或所含成分相對比例發(fā)生變化時都會影響整體藥效的發(fā)揮。

[1]Watanabe-Fukuda Y，Yamamoto M，Miura N，et al.Orengedokuto and berberine improve indomethacin-induced small intestinal injury via adenosine[J].J Gastroenterol，2009，44（5）：380.

[2]Hwang YS，Shin CY，Huh Y，et al.Hwangryun-Hae-Doktang（Huanglian-Jie-Du-Tang）extract and its constituents reduce ischemia-reperfusion brain injury and neutrophil infiltration in rats[J].Life Sci，2002，71（18）：2105.

[3]李 冀.方劑學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：112-113.

[4]孫 健，馬吉勝，金 瑾，等.黃連解毒湯各成分的HPLC-UV/MS定性與定量測定方法研究[J].藥學(xué)學(xué)報，2006，41（4）：380.

[5]汪 濤.HPLC法同時測定黃連解毒湯中3種有效成分的含量[J].中國藥房，2009，20（18）：1410.

[6]王 凌，洪筱坤.黃連解毒湯中生物堿含量的拆方研究[J].中成藥，2003，25（11）：912.

[7]宋 玨，路 通，謝 林，等.以血清藥理學(xué)方法研究黃連解毒湯對小鼠的藥效動力學(xué)[J].中草藥，2005，36（5）：709.

[8]金 瑾，段冷昕，孫 健，等.黃連解毒湯對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護作用[J].中國藥學(xué)雜志，2008，43（5）：344.