高妮，龔又明（1.廣州市醫(yī)藥職業(yè)學(xué)校，廣州市 510430；.廣東省中醫(yī)院，廣州市 51010）

柴胡是一味常用中藥，具有和解表里、疏肝、升陽(yáng)等功效。用于感冒發(fā)熱、寒熱往來(lái)、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等證的治療[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，柴胡具有解熱、抗病毒、抗細(xì)菌內(nèi)毒素、抗炎、降血脂、促酶分泌、保肝、提高免疫力、抗腫瘤、抗驚厥等作用[2～4]。常見的柴胡入藥炮制品有：生柴胡、醋柴胡和酒柴胡。2010年版《中國(guó)藥典》只收載了醋柴胡，但柴胡不同炮制品在臨床上具有不同的功效：生柴胡升散作用力強(qiáng)，用于解表退熱；醋炒后獨(dú)入肝經(jīng)血分，增強(qiáng)其疏肝和血、止痛之功，用于郁熱或瘀熱[5]。前期試驗(yàn)表明，柴胡經(jīng)醋炙后，柴胡皂苷a、d均有不同程度的降低，而柴胡皂苷b2則大大增加，可能是疏肝的主要成分。目前，對(duì)柴胡的炮制工藝主要為酒炙和醋炙2種。本研究首次采用微波炮制法優(yōu)化醋制柴胡的炮制工藝，并與傳統(tǒng)的醋炙法進(jìn)行比較，力求尋找出醋制柴胡的新方法。

1 儀器與試藥

Agilent-1100高效液相色譜儀，包括DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣、四元泵（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；WD800B型格蘭仕微波爐（廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司）；UV-2401PC紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ-300VDB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）；BS210S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

柴胡皂苷a、b2標(biāo)準(zhǔn)品（南京蘇朗醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，純度＞98%，批號(hào)分別為20090411、20090624）；柴胡藥材采購(gòu)于廣州清平中藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為正品北柴胡；乙腈為色譜純，甲醇、乙醇、氨水、磷酸、二甲氨基苯甲醛均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)的炮制方法

醋炙法：取柴胡藥材20 g，加入米醋，悶潤(rùn)約2 h，待輔料被吸盡后放入炒鍋內(nèi)，文火加熱，炒干，取出放涼，備用（每100 kg藥材加20 kg米醋）。

2.2 微波炮制法

選擇對(duì)柴胡質(zhì)量可能產(chǎn)生影響的4個(gè)因素：醋用量（A）、微波熱力（B）、加熱時(shí)間（C）、藥材鋪疊厚度（D）作為微波炮制的考察因素。每個(gè)因素選擇3個(gè)水平（見表1）。試驗(yàn)取柴胡藥材20 g，加入適量米醋，悶潤(rùn)約2 h，待輔料被吸盡后根據(jù)L9（34）正交試驗(yàn)表安排進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

2.3 柴胡皂苷b2的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Dikma kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（B）-水（A），梯度洗脫（0～15 min，30%→35%B；15～30 min，35%B；30～70 min，35%→40%B）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：10 μL。色譜見圖1。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷b2標(biāo)準(zhǔn)品4.02 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.402 mg·mL-1的柴胡皂苷b2標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

圖1 高效液相色譜圖A.柴胡皂苷b2標(biāo)準(zhǔn)品；B.柴胡微波炮制品Fig 1 HPLC chromatogramsA.saikosaponin standard substance；B.microwave processed Bupleuri Radix

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取柴胡生品和炮制品粉末各0.5 g，置于錐形瓶中，加5%氨水-甲醇溶液30 mL，超聲提取1 h，放冷，過(guò)濾，濾渣用5 mL的5%氨水-甲醇溶液洗滌3次，過(guò)濾，合并濾液，濾液蒸干，用少量的甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，并少量多次的洗滌，用洗滌液稀釋至刻度，即得。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取柴胡皂苷b2標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定柴胡皂苷b2的峰面積。以柴胡皂苷b2進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝372.29X－81.217（r＝0.9998）。結(jié)果表明，柴胡皂苷b2進(jìn)樣量在0.402～8.04 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取柴胡皂苷b2標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果，柴胡皂苷b2峰面積積分值的RSD＝1.02%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批柴胡藥材，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件于0、12、24、36、48 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，柴胡皂苷b2峰面積積分值的RSD＝1.89%（n＝5），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批柴胡藥材樣品5份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μL。結(jié)果，柴胡皂苷b2峰面積積分值的RSD＝2.37%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取柴胡炮制品粉末0.5 g，精密稱定，加入適量柴胡皂苷b2的標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，柴胡皂苷b2的平均回收率為98.8%，RSD＝2.14%（n＝5）。

2.4 總皂苷的含量測(cè)定

2.4.1 供試品溶液的制備 精密稱取生柴胡或柴胡炮制品粉末0.4 g，精密加入濃度為5%的氨性甲醇50 mL，稱定其重量，浸泡30 min后超聲1 h，放冷至室溫，稱重，用5%的氨性甲醇液補(bǔ)足失重，過(guò)濾，取續(xù)濾液25 mL，70℃水浴濃縮，用甲醇溶解并定容至5 mL。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密吸取柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品6.12 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得濃度為0.612 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，加濃度0.1%對(duì)二甲氨基苯甲醛-乙醇溶液0.5 mL，于70℃水溫放置10 min，取出放置至室溫，再加磷酸4 mL，于70℃水溫放置5 min，取出放置至室溫，加入甲醇至刻度。以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法在535 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以柴胡皂苷a濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝0.0103c+0.0395（r＝0.9998）。結(jié)果表明，柴胡皂苷a檢測(cè)濃度在61.2×10-3～6.12×10-2μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

按“2.3”、“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定柴胡皂苷b2、總皂苷含量，以此為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行方差分析，優(yōu)選最佳炮制工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Result of analysis of variance

由表2、表3可知，以柴胡皂苷b2含量為考察指標(biāo)，影響微波炮制柴胡的程度依次為C（加熱時(shí)間）＞B（微波熱力）＞D（藥材鋪疊厚度）＞A（醋用量），B、C因素對(duì)炮制工藝有顯著性影響（P＜0.05），最佳的炮制工藝為A3B3C3D2；以總皂苷含量為指標(biāo)，影響微波炮制柴胡的程度依次為C＞B＞D＞A，各因素對(duì)柴胡炮制工藝均無(wú)顯著性影響，其最佳工藝為A2B1C1D2。如果因素B、D水平設(shè)計(jì)太大，藥材容易糊化或燒焦，且對(duì)總皂苷含量也有一定的影響，試驗(yàn)表明以B2D1為佳；同時(shí)考慮到因素A對(duì)2個(gè)指標(biāo)均無(wú)顯著性影響，從節(jié)約的角度考慮，以A1為佳。綜上所述，最佳的微波炮制工藝為A1B2C3D1，即醋的用量為每100 kg藥材加20 kg米醋，藥材平鋪厚度約為1 cm，以微波熱力為60%加熱6 min即可。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取同一批柴胡樣品，按“2.5”項(xiàng)下最佳的微波炮制工藝和“2.1”項(xiàng)下的炮制方法進(jìn)行炮制，然后按“2.3”、“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定柴胡生品及其炮制品中柴胡皂苷b2、總皂苷的含量。結(jié)果，柴胡生品中柴胡皂苷b2的含量為0.0371%，總皂苷為2.76%；微波炮制品中柴胡皂苷b2的含量為0.7218%，總皂苷為2.49%；醋炙柴胡中柴胡皂苷b2的含量為0.6844%，總皂苷為2.44%，表明微波炮制法具有一定的重復(fù)性，而微波炮制法和醋炙法得到的柴胡炮制品中柴胡皂苷b2和總皂苷的含量無(wú)顯著性差異。

3 討論

傳統(tǒng)炮制法生產(chǎn)過(guò)程中炮制火候、溫度、時(shí)間等較難掌握。溫度過(guò)高則產(chǎn)品易焦糊，過(guò)低則產(chǎn)品含水量較高，且費(fèi)工費(fèi)時(shí)。微波加熱具有穿透力強(qiáng)、內(nèi)外同時(shí)加熱、省工省時(shí)、加熱時(shí)間短，且炮制品外觀完整，無(wú)焦化、糊化現(xiàn)象[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，微波醋制柴胡，炮制品為黃色，具有醋氣，無(wú)焦化或糊化的現(xiàn)象，符合柴胡炮制品的要求。

試驗(yàn)采用紫外-可見分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，測(cè)得柴胡皂苷b2分別在243、250、260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，其中250 nm吸收強(qiáng)度較大，因此選擇250 nm為柴胡皂苷b2最佳的檢測(cè)波長(zhǎng)。而對(duì)總皂苷含量測(cè)定最佳波長(zhǎng)的選擇，本試驗(yàn)以柴胡皂苷a作為標(biāo)準(zhǔn)品，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，柴胡皂苷a在535 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇535 nm為柴胡總皂苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。

前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，柴胡經(jīng)醋制后，柴胡皂苷a、d含量均有不同程度的降低，而柴胡皂苷b2含量則大大增加，這可能是疏肝的主要成分。而柴胡總皂苷是評(píng)價(jià)柴胡質(zhì)量的主要成分之一，因此選擇柴胡皂苷b2和總皂苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合飲片的外觀來(lái)篩選微波炮制工藝。結(jié)果表明，微波炮制法中的柴胡皂苷b2和總皂苷的含量均略高于傳統(tǒng)的醋炙法，并且炮制的飲片外觀也能達(dá)到要求。驗(yàn)證試驗(yàn)也表明，微波炮制工藝穩(wěn)定、可行，因此微波炮制法可作為代替?zhèn)鹘y(tǒng)醋炙法的新方法。

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